310 10*1მმ უჟანგავი ფოლადის დახვეული მილის ქიმიური კომპონენტი, სპიდროინის N-ტერმინალური დომენები ქმნიან ჰიდროგელებს ამილოიდური ფიბრილების საფუძველზე და უზრუნველყოფს პლატფორმას ცილების იმობილიზაციისთვის.

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
სლაიდერები, რომლებიც აჩვენებს სამ სტატიას თითო სლაიდზე.გამოიყენეთ უკანა და შემდეგი ღილაკები სლაიდებში გადასაადგილებლად, ან სლაიდის კონტროლერის ღილაკები ბოლოს თითოეულ სლაიდში გადასაადგილებლად.

სპეციფიკაცია

310 10*1მმ უჟანგავი ფოლადის დახვეული მილების მომწოდებლები

Ქიმიური შემადგენლობა

Მექანიკური საკუთრება

ობობის აბრეშუმის რეკომბინანტულ პროტეინებს (ობობის აბრეშუმის პროტეინებს) ბევრი პოტენციური გამოყენება აქვთ ახალი ბიომასალების შემუშავებაში, მაგრამ მათი მულტიმოდალური და აგრეგაციისადმი მიდრეკილი ბუნება ართულებს მათ მოპოვებას და მარტივ გამოყენებას.აქ ჩვენ ვატყობთ, რომ რეკომბინანტული მინიატურული სპიდროინის პროტეინები და, რაც მთავარია, თავად N-ტერმინალური დომენი (NT) სწრაფად ქმნიან თვითდამხმარ და გამჭვირვალე ჰიდროგელს 37 °C ტემპერატურაზე.შერწყმა ცილები, რომლებიც შედგება NT და მწვანე ფლუორესცენტური ცილისგან ან პურინის ნუკლეოზიდის ფოსფორილაზასგან, ქმნიან სრულად ფუნქციურ შერწყმა ცილებს.ჰიდროგელები.ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ რეკომბინანტული NT და შერწყმული პროტეინები უზრუნველყოფენ მაღალი ექსპრესიულობის გამომუშავებას და ანიჭებენ ჰიდროგელებს მიმზიდველ თვისებებს, როგორიცაა გამჭვირვალობა, გელაცია ჯვარედინი კავშირის გარეშე და აქტიური ცილების პირდაპირი იმობილიზაცია მაღალი სიმკვრივით.
ობობებს აქვთ აბრეშუმის ჯირკვლის შვიდი განსხვავებული ნაკრები, რომელთაგან თითოეული გამოიმუშავებს აბრეშუმის სპეციფიკურ ტიპს.შვიდივე აბრეშუმის სახეობა შედგება ობობის აბრეშუმის პროტეინებისგან (სპიდროინები) დაახლოებით 6000 ნარჩენებისგან და შეიცავს დიდ ცენტრალურ განმეორებით რეგიონს, რომელიც გარშემორტყმულია სფერული N- და C-ტერმინალური დომენებით (NT და CT)1,2.აბრეშუმის ყველაზე ფართოდ შესწავლილი ტიპი, პირველადი ამპულა, წარმოიქმნება პირველადი ამპულას ჯირკვლის მიერ.ამ ჯირკვალში ეპითელური უჯრედების მონოშრე სინთეზირებს სპიდროინის პროტეინებს და გამოყოფს მათ ჯირკვლის სანათურში, სადაც ისინი წარმოდგენილია ხსნადი ფორმით (დოპინგი) უკიდურესად მაღალი კონცენტრაციით (30-50% w/v)3,4.ჯირკვალში ძირითადი ამპულარული სპიდროინის ცილების ორგანიზაცია და კონფორმაცია განხილულია, მაგრამ ექსპერიმენტული მტკიცებულებების უმეტესობა მიუთითებს ზოგადად ხვეული და/ან შემთხვევითი სპირალური კონფორმაციისა და მიცელარული ან ლამელარული სტრუქტურების არსებობაზე5,6,7,8,9,10.მიუხედავად იმისა, რომ განმეორებადი დომენები არეგულირებს აბრეშუმის ბოჭკოების მექანიკურ თვისებებს, ქმნიან β-ფურცლის ნანოკრისტალებს და ამორფულ სტრუქტურებს11,12,13,14,15, ბოლო დომენები არეგულირებენ აბრეშუმის ბოჭკოებს აბრეშუმის ჯირკვლის გასწვრივ ცვალებად პირობებში16,17,18.აბრეშუმის წარმოქმნის კონტროლით, 19. ტერმინალური დომენები ევოლუციურად არის შენარჩუნებული და მათი ფუნქცია შეიძლება იყოს საერთო ყველა სპიდროინის ცილისთვის 2,20,21.ჯირკვალში გავლისას, სპიდროინის pH მცირდება დაახლოებით 7,6-დან < 5,716-მდე და იზრდება ათვლის და გაჭიმვის დროს, რომელიც შუამავლობს თანდათანობით ვიწრო სადინარში მოძრაობით.ხსნარში, CT არის α-სპირალი კონსტიტუციური პარალელური დიმერი17, მაგრამ დაბალი pH-ის და ათვლის ძალების საპასუხოდ, CT ​​იშლება და ცვლის β- ფენებს16, 17, შესაძლოა გამოიწვიოს β- ფენები Convert 16-ის განმეორებით რეგიონებში. NT არის მონომერული. პირობები, რომლებიც ასახავს პირობებს ჯირკვლის სანათურში და შუამავლობს სპიდროინის ხსნადობას, მაგრამ შემცირებული pH-ის დროს, კარბოქსილის მჟავას რიგი გვერდითი ჯაჭვების პროტონაცია იწვევს NT-ის დიმერიზაციას pKa დაახლოებით 6,5-ით, რითაც სტაბილიზდება NT და აფიქსირებს სპიდროინს დიდი რაოდენობით. რაოდენობები.ქსელები16,18.ამრიგად, NT თამაშობს მთავარ როლს ძაფის ფორმირებაში, იცვლება მონომერიდან საფარში დიმერში ბოჭკოში23,24,25.NT რჩება უაღრესად ხსნადი და ხვეული ყველა პირობებში შესწავლილი დღემდე16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, რამაც შთააგონა მისი განვითარება, როგორც ხსნადობის გამაძლიერებელი ეტიკეტი ჰეტეროლოგიური ცილების წარმოებისთვის.
რეკომბინანტული მინი ობობის აბრეშუმის ცილა, რომელიც შედგება ერთი NT, ერთი მოკლე განმეორებითი რეგიონისგან, ერთი CT და His6 ტეგისგან (His-NT2RepCT) გასაწმენდად, ისევე ხსნადი წყალში ბუფერში, როგორც ობობის აბრეშუმის ცილა და მიბაძავს აბრეშუმის ობობის მნიშვნელოვან მახასიათებლებს. .გაშუქება 25.31.His-NT2RepCT შეიძლება დაწნული იყოს უწყვეტ ბოჭკოებად ბიომიმეტური აპარატის გამოყენებით, რომელშიც pH 8 ხსნადი საფარი იხსნება pH 525,32,33,34,35 წყლის აბაზანაში.E. coli-ის ბიორეაქტორული დუღილი, რომელიც გამოხატავს His-NT2RepCT-ს და შემდგომ დამუშავებას, იწვევდა >14 გ/ლ გამოსავლიანობას გაწმენდის შემდეგ.მაღალი მოსავლიანობა, მაღალი ხსნადობა და His-NT2RepCT-ის ადეკვატური რეაქცია მჟავე პირობებზე მიეკუთვნება NT23, 25, 34-ს.
აქ ჩვენ ვახსენებთ გამჭვირვალე ჰიდროგელების სწრაფ წარმოქმნას რეკომბინანტული სპიდროინის ცილებისგან, მათ შორის მხოლოდ NT, ცილის ხსნარის ინკუბაციით 37 °C ტემპერატურაზე.თიოფლავინის T ფლუორესცენციის (ThT), ფურიეს ტრანსფორმაციის ინფრაწითელი სპექტროსკოპიის (FTIR), ბირთვული მაგნიტურ-რეზონანსული სპექტროსკოპიის (NMR) და გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპის (TEM) გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ NT და მიკროობობის ცილები განიცდიან სტრუქტურულ ტრანსფორმაციას β-ფურცლებში და ამილოიდის მსგავს ბოჭკოებად. როდესაც გელები წარმოიქმნება.გარდა ამისა, NT და მწვანე ფლუორესცენტური პროტეინის (GFP) ან პურინის ნუკლეოზიდის ფოსფორილაზას (PNP) შერწყმის ცილები ქმნიან ჰიდროგელებს სრულად ფუნქციონალური შერწყმის ფრაგმენტებით.მაღალი გამტარუნარიანობის გამოხატულება ჰეტეროლოგიურ მასპინძლებში, ფიზიოლოგიურ პირობებში ჰიდროგელების სწრაფ წარმოქმნასთან ერთად, ხსნის ინჟინერიული ფუნქციების მქონე ჰიდროგელების ეკონომიური წარმოების შესაძლებლობას.
განსხვავებით რეკომბინანტული სპიდროინის პროტეინების უმეტესობისგან36, His-NT2RepCT სტაბილურია Tris-HCl ბუფერში pH 8-ზე და შეიძლება კონცენტრირებული იყოს 500 მგ/მლ-მდე ნალექის გარეშე25.ამიტომ, ჩვენ გაგვიკვირდა, რომ აღმოვაჩინეთ, რომ ეს ცილა სწრაფად აყალიბებს ოპტიკურად გამჭვირვალე, თვითშენარჩუნებულ ჰიდროგელებს, როდესაც ინკუბირებულია 37°C-ზე (ნახ. 1b-d).შემდგომმა კვლევებმა აჩვენა, რომ His-NT2RepCT გელაცია ხდებოდა ცილის კონცენტრაციების ფართო დიაპაზონში (10-300 მგ/მლ) და რომ ეს კონცენტრაცია საპირისპირო კორელაციაში იყო გელაციის დროს (ნახ. 1c და დამატებითი ნახ. 1).იმის გასარკვევად, თუ რომელი ნაწილებია His-NT2RepCT ჰიდროგელის ფორმირებაში, ჩვენ გამოვიკვლიეთ თითოეული დომენი ინდივიდუალურად და სხვადასხვა კომბინაციებში კოლბის ინვერსიის ანალიზის გამოყენებით (სურათი 1a,b).რეკომბინანტული სპიდროინის ყველა შემოწმებულმა ფრაქციამ წარმოქმნა გელები (ცილის კონცენტრაციით 300 მგ/მლ) 1 საათზე ნაკლებ დროში, გარდა ნალექიანი 2რეპ (ნახ. 1ბ).ეს მიგვითითებს იმაზე, რომ NT და CT მარტო, კომბინაციაში ან ასოცირებულ გამეორებებთან, შეუძლიათ გელი 37°C-ზე და რომ His6 ტეგი არ ახდენს გავლენას ამ პროცესზე რაიმე მნიშვნელოვან ზომით.გავრცელებული მოსაზრების გათვალისწინებით, რომ NT არის უაღრესად ხსნადი და სტაბილური ცილა, და რომ რეკომბინანტული სპიდროინის ჰიდროგელების წინა მოხსენებები ანიჭებდნენ გელაციურ ეფექტებს განმეორებით რეგიონებში და/ან CT-ებში კონფორმაციულ ცვლილებებს, თავად NT-ს შეეძლო.გელატის აღმოჩენა მოულოდნელი იყო.დამატებითი ცხრილი 1) 37, 38, 39. აღსანიშნავია, რომ NT უკვე გელდებოდა 10 წუთში ≥ 300 მგ/მლ კონცენტრაციით (ნახ. 1c).ფლაკონის ინვერსიის ექსპერიმენტებმა NT-ის სხვადასხვა კონცენტრაციით აჩვენა, რომ >50 ​​მგ/მლ-ზე NT ხსნარი უფრო სწრაფად გელდებოდა, ვიდრე His-NT2RepCT შესაბამის კონცენტრაციაზე (w/v, სურათი 1c).
ამ ნაშრომში შესწავლილი სხვადასხვა სპიდროინის კონსტრუქციის სქემატური წარმოდგენა.b ლარის დრო 37 °C-ზე სხვადასხვა რეკომბინანტული სპიდროინის პროტეინებისთვის (300 მგ/მლ), დამოწმებული ფლაკონის ინვერსიით.CT გელი დაუყოვნებლივ ინკუბაციის გარეშე (<300 მგ/მლ), 2Rep ნალექი (300 მგ/მლ, 5 მმ მასშტაბი).c His-NT2RepCT და NT-ის გელის დრო ცილის მითითებულ კონცენტრაციებზე 37°C-ზე.d His-NT2RepCT და NT ჰიდროგელების ფოტოები ობობის ქვეშ და ასო „NT“ დაბეჭდილი, შესაბამისად (ორივე 200 მგ/მლ, მასშტაბის ზოლი 5 მმ).
ჰიდროგელებს, რომლებიც წარმოიქმნება სხვადასხვა რეკომბინანტული სპიდროინის პროტეინებით, აქვთ ოდნავ განსხვავებული ფერები და შეუიარაღებელი თვალით დაკვირვება აჩვენებს გამჭვირვალობის სხვადასხვა ხარისხს (ნახ. 1ბ).NT გელები განსაკუთრებულად გამჭვირვალეა, ხოლო სხვა გელები ხდება გაუმჭვირვალე.ცილინდრულ მილებში გადაყრილი His-NT2RepCT და NT გელები შეიძლება ამოღებულ იქნეს ყალიბიდან ხელუხლებლად (ნახ. 1დ).
იმის შესამოწმებლად, არის თუ არა ბუნებრივი ობობის აბრეშუმის საფარის გელი იმ პირობებში, რომლებიც ახლა დადგინდა, რომ იწვევს რეკომბინანტული სპიდროინის ცილების გელაციას, საფარები შეგროვდა შვედური ხიდის ობობის დიდი ამპულის ჯირკვლიდან (Larinioides sclopetarius).საფარები ინახებოდა 20 მმ Tris-HCl ბუფერში 50 მგ/მლ-ზე (გაზომილი მშრალ წონაზე დაყრდნობით), მაგრამ 21-დღიანი ინკუბაციის დროს 37 °C-ზე არ შეინიშნებოდა გელაცია (დამატებითი სურათი 2a).
ამ გელების რაოდენობრივად დასადგენად, რეოლოგიური გაზომვები შეიძლება გამოყენებულ იქნას გელაციის პროცესის შესასწავლად და საერთო მექანიკური თვისებების დასადგენად.კერძოდ, შენახვის მოდულის (ელასტიურობის) მონიტორინგს ამაღლებულ ტემპერატურაზე შეუძლია მოგაწოდოთ ინფორმაცია გელის ტემპერატურისა და საფარის ვისკოელასტიური თვისებების შესახებ.ტემპერატურის მატების ექსპერიმენტებმა (1°C/წთ 25-45°C-ზე, წინა კვლევებზე დაფუძნებული ბუნებრივი აბრეშუმის მარაგის ხსნარების გამოყენებით)40,41 აჩვენა, რომ His-NT2RepCT და NT ხსნარების შენახვის მოდულები იზრდებოდა ტემპერატურის მატებასთან ერთად.გაიზარდა (ნახ. 2 და დამატებითი ნახ. 3).აღსანიშნავია, რომ NT მოდულმა დაიწყო ზრდა დაბალ ტემპერატურაზე His-NT2RepCT-თან შედარებით, რაც შეესაბამება გელის უფრო სწრაფ დროს დაფიქსირებულს, როდესაც NT პირდაპირ ინკუბირებული იყო His-NT2RepCT 37°C-ზე (სურათი 1).ტემპერატურის შემდგომი ვარდნის შემდეგ, შენახვის მოდული არ დაბრუნდა დაბალ მნიშვნელობებზე და დარჩა დანაკარგის მოდულზე მაღლა (იხ. დამატებითი სურათი 3), რაც მიუთითებს თერმულად შეუქცევად სტაბილურ ჟელაციაზე.გელაციის შემდეგ, ელასტიურობის საბოლოო მოდული მერყეობდა 15-დან 330 კპა-მდე His-NT2RepCT ჰიდროგელების კონცენტრაციით 100-500 მგ/მლ, ხოლო ელასტიურობის საბოლოო მოდული NT ჰიდროგელებისთვის (100-500 მგ/მლ) მერყეობდა 2-დან 1400-მდე. kPa (ნახ., 2 და სრული რამპის მონაცემები) იხილეთ დამატებითი ნახ. 3).
a ტემპერატურის ცვლილება His-NT2RepCT (300 მგ/მლ) და b NT (300 მგ/მლ) გაზომვების დროს შერყევის დროს.ისრები მიუთითებს ტემპერატურულ ტენდენციაზე, ხოლო შენახვის მოდულის მონაცემების უფრო მსუბუქი დაჩრდილვა ასახავს მწარმოებლის მიერ მითითებულზე დაბალ ბრუნვის მნიშვნელობებზე ტესტირებას ინსტრუმენტისთვის, რაც გაზრდილი ხმაურის მიზეზია.c His-NT2RepCT-ისა და NT-ის ბოლო მოდულის დაგროვება მომატებული ტემპერატურის შემდეგ (100, 300 და 500 მგ/მლ).ყველა მოდულის კითხვა აღებულია 0,1 ჰც სიხშირით.
როგორც გელატაციასთან დაკავშირებული კონფორმაციული ცვლილებების გამოკვლევის პოტენციური მეთოდი, ჩვენ ჩავწერეთ His-NT2RepCT და NT-ის FTIR სპექტრები გელატაციამდე და შემდეგ 37°C ტემპერატურაზე (სურათი 3a,b).როგორც მოსალოდნელი იყო, His-NT2RepCT და NT ხსნარების სპექტრები შეესაბამებოდა პროტეინებს, რომლებიც აჩვენებენ α-სპირალი/შემთხვევითი ხვეულის მეორად სტრუქტურას, გამოხატული ზოლით 1645 სმ-1-ზე.ორივე ჰიდროგელისთვის გელაციამ გამოიწვია ორი მკლავის წარმოქმნა შუა I ზოლში დაახლოებით 1617 სმ-1 და 1695 სმ-1 (ნახ. 3a, b), რაც მიუთითებს ანტიპარალელური β-ფურცლის სტრუქტურების ფორმირებაზე.ეს ცვლილებები ასევე ნათლად ჩანს შესაბამის მეორე წარმოებულსა და განსხვავებულ გელაციის სპექტრში (დამატებითი სურ. 4b).NT β-ფენის ორი ზოლი უფრო გამოხატული იყო ვიდრე His-NT2RepCT, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ β-ფენის ზოლების მთლიანი შემცველობა NT ჰიდროგელში უფრო მაღალი იყო ვიდრე NT2RepCT ჰიდროგელის.
FTIR შთანთქმის სპექტრი His-NT2RepCT და b NT (ორივე 500 მგ/მლ) ინკუბაციამდე (ხსნარი) და (გელის) შემდეგ 37°C-ზე.c ხელახლა შეჩერებული 50 მგ/მლ NT2RepCT გელების TEM სურათები და d NT.მასშტაბის ზოლი 200 ნმ.e His-NT2RepCT და NT ჰიდროგელების ბოჭკოვანი დიამეტრი.n = 100 გაზომილი ფიბრილი, p <0.0001.შეცდომის ზოლები აჩვენებს სტანდარტულ გადახრას.შეცდომის ზოლების ცენტრი არის საშუალო.სტატისტიკური ანალიზისთვის გამოყენებული იყო დაუწყვილებელი t-ტესტი (ორკუდიანი).f ThT სხვადასხვა რეკომბინანტული სპიდროინის ცილების (100 მგ/მლ) ფლუორესცენცია 37 °C-ზე შერყევის გარეშე.გ NT (100 მგ/მლ) ინოკულაციის ექსპერიმენტები 100 მგ/მლ NT გელისგან 0%, 5%, 10% და 20% თესლით.
გელის ანალიზმა გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპის (TEM) გამოყენებით აჩვენა, რომ ჰიდროგელი შედგება ამილოიდის მსგავსი ფიბრილებისაგან (ნახ. 3c, 3d).NT-ფორმირებული ფიბრილები იყო წაგრძელებული (5-12 ნმ დიამეტრით) და განშტოებული, ხოლო His-NT2RepCT ფიბრილები იყო უფრო მოკლე სიგრძით და მნიშვნელოვნად ფართო დიამეტრით (7-16 ნმ) (ნახ. 3e).ამ შედეგებმა მოგვცა საშუალება მივყვეთ ფიბროზის კინეტიკას თიოფლავინის T (ThT) ანალიზის გამოყენებით.ყველა რეკომბინანტული სპიდროინის ცილისთვის, ფლუორესცენტური სიგნალი გაიზარდა, როდესაც ნიმუშები ინკუბირებული იყო 37 °C-ზე (ნახ. 3f, დამატებითი სურ. 5a).ამ დასკვნის შესაბამისად, NT და His-NT2RepCT-ის მიკროსკოპული გამოკვლევა გელის პირობებში გამოავლინა ThT ფლუორესცენციის ერთგვაროვანი ზრდა ThT-დადებითი აგრეგატების შესამჩნევი ადგილობრივი დაგროვების გარეშე (დამატებითი სურ. 5b,c).ThT-დადებითი ფიბრილების წარმოქმნას არ ახლდა NT და His-NTCT სიმღვრივის მატება (დამატებითი სურ. 5d), რაც ნიშნავს, რომ გელში ფიბრილების ქსელი შეიძლება ჩამოყალიბდეს გელის გამჭვირვალობის გარეშე.მცირე რაოდენობით წინასწარ ჩამოყალიბებული ფიბრილების დამატებით დათესვამ შეიძლება მნიშვნელოვნად დააჩქაროს ზოგიერთი ამილოიდის ფიბრილების წარმოქმნა42,43,44, მაგრამ NT ჰიდროკოაგულანტების ხსნარში 5%, 10% ან 20% (w/w) NT დამატება.დათესვის ეფექტი (ნახ. 3გ).შესაძლოა ეს იმით არის განპირობებული, რომ ჰიდროგელში ფიბრილები შედარებით ფიქსირდება და თესლად გამოყენება არ შეიძლება.
რეკომბინანტული სპიდროინის ცილების მოულოდნელმა ქცევამ მაღალ ტემპერატურაზე აიძულა შემდგომი ბირთვული მაგნიტურ-რეზონანსული (NMR) სპექტროსკოპიული კვლევები გელის წარმოქმნასთან დაკავშირებული კონფორმაციული ცვლილებების დასადგენად.His-NT2RepCT ხსნარების NMR სპექტრები, ჩაწერილი დროთა განმავლობაში 37°C-ზე, აჩვენა, რომ CT ჯერ კიდევ ნაწილობრივ დაკეცილი იყო, ხოლო NT და 2Rep სიგნალები გაქრა (ნახ. 4a), რაც ვარაუდობს, რომ ძირითადად NT და 2Rep იყო ის, რომ ნაწილობრივ აკონტროლებდა His- ფორმირებას. NT2RepCT ჰიდროგელი.CT სიგნალი ასევე შესუსტდა მისი საწყისი ინტენსივობის 20%-მდე, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ CT ასევე ძირითადად ფიქსირდება და ჩართულია ჰიდროგელის სტრუქტურაში.CT-ის უფრო მცირე ნაწილისთვის, რომელიც ისეთივე მობილურია, როგორც წინასწარ ინკუბირებულ ნიმუშში და ამგვარად დაფიქსირდა ხსნარის NMR, სპექტრებს აკლია სიგნალები პირველი 10 სტრუქტურირებული ნარჩენისთვის, შესაძლოა, His-NT2Rep-ის მიმაგრებული ნაწილის რთული იმობილიზაციის გამო.ჰიდროგელების -მდგომარეობის NMR სპექტრებმა -NT2RepCT გამოავლინა α-სპირალისა და β-ფენების უპირატესი არსებობა და, უფრო მცირე ზომით, ხვეულის შემთხვევითი კონფორმაცია (ნახ. 4b).მხოლოდ NT-ში არსებული მეთიონინის ნარჩენების ქიმიური ცვლის ანალიზმა აჩვენა, რომ ეს დომენი გადაკეთდა β-ფურცლის სტრუქტურად.ხსნარში NT-ის დროზე დამოკიდებული სპექტრები აჩვენებდნენ სიგნალის ინტენსივობის ერთგვაროვან შემცირებას (ნახ. 4c) და NT ჰიდროგელების მყარი მდგომარეობის NMR აჩვენა, რომ NT ნარჩენების უმეტესობა გადაკეთდა β-ფურცლის სტრუქტურებად (ნახ. 4d).2Rep-ის კონფორმაცია ცალკე ვერ განისაზღვრა მისი აგრეგაციის ტენდენციის გამო.თუმცა, NTCT და His-NT2RepCT ჰიდროგელების მყარი მდგომარეობის NMR სპექტრები ძალიან ჰგავდა (ნახ. 4b; დამატებითი ნახ. 6b), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ 2Rep მცირე წვლილი შეიტანა His-NT2RepCT ჰიდროგელის სტრუქტურულ ნაწილში.CT ჰიდროგელებისთვის, აღმოჩნდა, რომ არსებობს α-სპირალი, β-ფურცლები და შემთხვევითი სპირალური მეორადი სტრუქტურები (დამატებითი სურ. 6d).ეს ვარაუდობს, რომ CT-ის ზოგიერთი ნაწილი რჩება α-სპირალებად, ზოგი კი β- ფურცლებად იქცევა.ამრიგად, NMR სპექტროსკოპიის შედეგები ვარაუდობს, რომ NT მნიშვნელოვანია ჰიდროგელის ფორმირებისთვის და ასევე გარდაიქმნება β-ფურცლის კონფორმაციად 2Rep და CT-თან შერწყმისას.ამის შესაბამისად, ჩვენ ახლახან აღმოვაჩინეთ, რომ ამილოიდური სივრცითი ელვა, სავარაუდოდ, იქმნება NT დომენის ხუთივე ხვეულში და ვალსის ალგორითმი იწინასწარმეტყველა ამილოიდოგენური რეგიონი სპირალში 1 (ნახ. 4e).
15N-HSQC 10 მგ/მლ His-NT2RepCT ხსნარის 2D სპექტრები (ლურჯი) და ინკუბაციიდან 19 საათის შემდეგ (წითელი) 37°C-ზე.ცალკეული ჯვარედინი პიკები წითელ სპექტრში და F24, G136, polyA ლურჯ სპექტრში აღინიშნება ერთი ასო ამინომჟავის სიმბოლოებით და ნარჩენების ნომრებით.ჩანართი აჩვენებს სიგნალის ინტენსივობის დამოკიდებულებას დროზე შერჩეული ნარჩენებისთვის NT, 2Rep და CT დომენებიდან.b His-NT2RepCT ჰიდროგელების მყარი მდგომარეობის რადიოსიხშირული (RFDR) სპექტრები.RFDR სპექტრებში დაფიქსირებული Ca/Cβ ნარჩენების კორელაციები განისაზღვრა სამოდელო პეპტიდის ქიმიურ ძვრებთან და სტატისტიკით82,83 და მათი მეორადი სტრუქტურებიდან მიღებული მნიშვნელობების შედარებით.SSB - მბრუნავი გვერდითი ზოლი.c 15N-HSQC 10 მგ/მლ NT ხსნარის ერთგანზომილებიანი სპექტრები ინკუბაციის დროს 37 °C-ზე 36 საათის განმავლობაში.ჩანართი აჩვენებს მოცულობითი ინტენსივობას დროის მიმართ.d NT ჰიდროგელების მყარი მდგომარეობის RFDR სპექტრები.მითითებულია Ca/Cβ ნარჩენების და მათი მეორადი სტრუქტურების კორელაციები, რომლებიც დაფიქსირდა RFDR სპექტრებში.e დაფუძნებულია NT45.79 ფიბრილაციის მიდრეკილების პროფილზე Zipper მონაცემთა ბაზიდან (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).ჰექსაპეპტიდის სივრცითი ელვისებური ცვლის ფანჯრის როზეტას ენერგია ნაჩვენებია კკალ/მოლში.წითელი ზოლები აღნიშნავს ჰექსაპეპტიდებს მაღალი ფიბროზული მიდრეკილებით (როზეტას ენერგია -23 კკალ/მოლზე ქვემოთ; წერტილოვანი ხაზის ქვემოთ).მწვანე ზოლები მიუთითებს ფრაგმენტებზე როზეტას ენერგიით ზღურბლზე ზემოთ და, შესაბამისად, ნაკლებად სავარაუდოა, რომ ჩამოყალიბდეს სტერული ელვა.პროლინის შემცველი ფრაგმენტები გამოირიცხა ანალიზიდან (სვეტების გარეშე).კვადრატები მიუთითებს ამილოიდოზის უბნებზე, რომლებიც პროგნოზირებულია ვალსის ალგორითმით81 (https://waltz.switchlab.org).NT-ის ამინომჟავების ნარჩენების თანმიმდევრობა არის ზედა, ხოლო ნარჩენების ტიპები, რომლებიც გვხვდება β მეორად სტრუქტურაში (განსაზღვრულია მყარი მდგომარეობის NMR სპექტროსკოპიით) ნაჩვენებია წითლად.ხუთი NT α-სპირალის პოზიციები მითითებულია როგორც (H1-H5)28.
pH <6,5-ზე, HT დიმერიზდება და მდგრადია სითბოს ან შარდოვანას გამოწვეული დენატურაციის მიმართ18.იმის გასარკვევად, თუ როგორ მოქმედებს NT-ის დიმერიზაცია და სტაბილურობა გელატაციაზე, ხსნარები, რომლებიც შეიცავდნენ 100 მგ/მლ NT, კონტროლდებოდნენ pH 8, 7 და 6-ზე ფლაკონის ინვერსიის ტესტის გამოყენებით.NT ნიმუშები ინკუბირებულია pH 8-ზე და 7-ზე 30 წუთის შემდეგ 37 °C-ზე, მაგრამ pH 8 გელი დარჩა გამჭვირვალე, ხოლო pH 7 გელი აჩვენებდა ხილულ ნალექს (ნახ. 5a).ამის საპირისპიროდ, ხსნარმა, რომელიც შეიცავს HT-ს pH 6-ზე, არ წარმოქმნის გელს და დიდი ნალექი ჩანს 20 წუთის შემდეგ 37°C ტემპერატურაზე.ეს იმაზე მეტყველებს, რომ თავად დიმერები და/ან მათი უფრო მაღალი სტაბილურობა მონომერებთან შედარებით ხელს უშლის გელაციას.NT-სთვის ნალექის წარმოქმნა pH 7 და 6-ზე მოსალოდნელი არ იყო, რადგან მოხსენებული იყო, რომ NT ხსნადია 200 მგ/მლ27-ზე, ადვილად იკეცება სითბოს დენატურაციის შემდეგ და ასევე ინარჩუნებს α-სპირალს უფრო დაბალ მნიშვნელობებზე. pH 18. ამ შეუსაბამობების სავარაუდო ახსნა არის ის, რომ ადრე მოხსენებული ექსპერიმენტები ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე ან ქვემოთ, ან ცილების შედარებით დაბალი კონცენტრაციით16,18,19.
NT ფლაკონის ინვერსიის ტესტი (100 მგ/მლ) pH 8, 7, 6 და 154 მმ NaCl (pH 8) ინკუბაციის შემდეგ 37°C-ზე.b NT CD სპექტრები 154 mM NaF და 154 mM NaCl და მის გარეშე, შესაბამისად.მოლური ელიფტიურობა 222 ნმ-ზე გარდაიქმნება ბუნებრივი ნაკეცების პროპორციად.c NT ინვერსიის ანალიზი (100 მგ/მლ) NT* (37 °C და 60 °C), NTA72R (37 °C) და His-NT-L6 (37 °C და 60 °C).d NT მუტანტების NT*, NTA72R და His-NT-L6 CD სპექტრები.მოლური ელიფტიურობა 222 ნმ-ზე გარდაიქმნება ბუნებრივი ნაკეცების პროპორციად.e NTFlSp, NTMiSp და შემცირებული NTMiSp (100 მგ/მლ) ინვერსიის ტესტი.სასწორის ზოლი 5 მმ.f CD სპექტრები NT, NTFlSp, NTMiSp და შემცირებული NTMiSp.მოლური ელიფტიურობა 222 ნმ-ზე გარდაიქმნება ბუნებრივი ნაკეცების პროპორციად.სრული NT სპექტრები 25 °C და 95 °C ნაჩვენებია დამატებით სურათზე 8.
მარილის ფიზიოლოგიური კონცენტრაცია განსაზღვრავს ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებას NT ქვედანაყოფებს შორის და NT-ის დიმერიზაციას დაბალ pH18-მდე გადაცემისკენ.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 154 მმ NaCl და NaF-ის არსებობა მართლაც აფერხებდა გელატაციას, შესაბამისად (ნახ. 5a, b; დამატებითი ნახ. 2b) და რომ ეს მარილები ზრდიდნენ NT მონომერების თერმულ სტაბილურობას (ნახ. 5b, დამატებითი ნახ. 8). .ის ასევე ვარაუდობს, რომ სტაბილურობის გაძლიერება, ვიდრე დიმერიზაცია, ხელს უშლის გელის წარმოქმნას.
პროტეინის დიმერიზაციისა და სტაბილურობის როლის შემდგომი შესასწავლად გელატაციაში, ჩვენ გამოვიყენეთ ორი მუტანტი, NT* და NTA72R, რომლებიც ასევე რჩება მონომერული დაბალი pH28.30-ზე.NT* არის ორმაგი მუხტის შებრუნებული მუტანტი, რომელშიც მონომერის აშკარა დიპოლარული მუხტის განაწილება გაბრტყელებულია, რაც ხელს უშლის დიმერიზაციას და მკვეთრად ზრდის მონომერის სტაბილურობას.NTA72R არის დამუხტული დიპოლი, მაგრამ არგ-ჩანაცვლებული Ala მდებარეობს დიმერის საზღვარზე, ამიტომ მუტაციები ერევა დიმერიზაციისთვის საჭირო ქვედანაყოფების ურთიერთქმედებებში.37°C-ზე ინკუბაციისას, NT* არ წარმოქმნის ჰიდროგელს, ხოლო NTA72R წარმოქმნის გაუმჭვირვალე გელს 15 წუთის განმავლობაში (ნახ. 5c).ვინაიდან NT* და NTA72R-საც არ შეუძლიათ დიმერიზაცია, მაგრამ განსხვავდებიან მონომერის სტაბილურობით (ნახ. 5d), ეს შედეგები მტკიცედ გვთავაზობს, რომ მაღალი თერმოდინამიკური სტაბილურობა ხელს უშლის NT-ს გელირებას.ამას ასევე მხარს უჭერს ის ფაქტი, რომ HT* წარმოქმნის გელს, როდესაც ის არასტაბილურია მაღალ ტემპერატურაზე (8 წუთის შემდეგ 60°C-ზე; სურ. 5c).ადრე ნაჩვენები იყო, რომ NT-ში მეთიონინის მაღალი შემცველობა თხევად აქცევს მის ბუნებრივ დაკეცვას და რომ ექვსი Met to Leu შემცვლელი (აქ მოიხსენიება როგორც His-NT-L6) ძლიერად ასტაბილურებს NT46 მონომერს.ვარაუდზე დაყრდნობით, რომ სტრუქტურული მოქნილობაა საჭირო NT გელის ფორმირებისთვის, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ His-NT-L6 სტაბილური მუტანტი არ გელი 37 °C ტემპერატურაზე (სურათი 5c, d).თუმცა, His-NT-L6 ასევე წარმოქმნის გელს 60°С-ზე 60 წუთის განმავლობაში ინკუბაციისას (ნახ. 5c).
NT-ის უნარი გარდაიქმნას β-ფურცლის სტრუქტურებად და შექმნას ჰიდროგელები, როგორც ჩანს, ვრცელდება სპიდროინის ზოგიერთ, მაგრამ არა ყველა NT დომენზე.NT-ები აბრეშუმის სხვადასხვა ტიპებიდან და ობობების სახეობებიდან, Trichonephila clavipes (NTFlSp), წარმოქმნიან გელებს, მიუხედავად მათი შედარებით დაბალი მეთიონინის შემცველობისა და მაღალი თერმული სტაბილურობისა (ნახ. 5e, f და დამატებითი ცხრილი 2).ამის საპირისპიროდ, NT მცირე ამპულარული ცილისგან სპიდროინიდან Araneus ventricosus (NTMiSp) დაბალი თერმული სტაბილურობით და მეთიონინის მაღალი შემცველობით არ წარმოქმნის ჰიდროგელს (დამატებითი ცხრილი 2 და სურ. 5e, f).ეს უკანასკნელი შეიძლება დაკავშირებული იყოს ინტრამოლეკულური დისულფიდური ბმების არსებობასთან29,47.თანმიმდევრულად, როდესაც NTMiSp-ის დისულფიდური ბმები შემცირდა, იგი წარმოქმნიდა ჰიდროგელს 37°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში ინკუბაციის შემდეგ (ნახ. 5e).დასასრულს, უნდა აღინიშნოს, რომ სტრუქტურული მოქნილობა არის მნიშვნელოვანი, მაგრამ არა ერთადერთი, კრიტერიუმი NT-დან გელის ფორმირებისთვის.კიდევ ერთი ფაქტორი, რომელიც შეიძლება იყოს რელევანტური, არის ამილოიდური ფიბრილების ფორმირებისადმი მიდრეკილება, ხოლო ელვარე მონაცემთა ბაზის და ვალსის ალგორითმის ანალიზმა აჩვენა კორელაცია გელის ფორმირების უნარსა და ამილოიდოგენური უბნების არსებობას, ისევე როგორც პროგნოზირებული რეგიონების მასშტაბებს შორის. სტერილური ელვაების ჩამოსაყალიბებლად.იყო კორელაცია (დამატებითი ცხრილი 2 და დამატებითი ნახ. 9).
NT-ის უნარმა შექმნას ფიბრილები და შექმნას გელები ხელსაყრელ პირობებში, მიგვიყვანა ჰიპოთეზამდე, რომ NT შერწყმა სხვა ცილის ფრაგმენტებთან შეიძლება კვლავ წარმოქმნას გელები, რომლებსაც აქვთ შერწყმის პარტნიორების სრული ფუნქცია.ამის შესამოწმებლად, ჩვენ შევიყვანეთ მწვანე ფლუორესცენტური ცილა (GFP) და პურინული ნუკლეოზიდური ფოსფორილაზა (PNP) NT-ის C-ბოლოზე, შესაბამისად.მიღებული შერწყმა პროტეინები გამოხატული იყო E. coli-ში ძალიან მაღალი საბოლოო გამოსავლით (150 მგ/ლ და 256 მგ/ლ შერყევის კოლბაში კულტურები His-NT-GFP და His-NT-PNP, შესაბამისად), რაც იყო ნაჩვენები. სხვა პროტეინებისთვის შერწყმული NT Ref.30. His-NT-GFP (300მგ/მლ) და His-NT-PNP (100მგ/მლ) შერწყმა პროტეინებმა წარმოიქმნა გელები 2 საათისა და 6.5 საათის შემდეგ 37°C ტემპერატურაზე და, რაც მთავარია, GFP ფრაქცია უცვლელი დარჩა.დაფიქსირდა გელაციის შემდეგ, საწყისი ფლუორესცენციის ინტენსივობის >70% რჩება გელაციის შემდეგ (ნახ. 6a).მისი-NT-PNP ხსნარებში და გელებში PNP-ის აქტივობის გასაზომად, ჩვენ მოგვიწია შერწყმის პროტეინის განზავება NT-ით, რადგან სუფთა პრეპარატის ფერმენტული აქტივობა სცილდებოდა ანალიზის გამოვლენის დიაპაზონს გელის კონცენტრაციებში.გელი, რომელიც წარმოიქმნა ნარევით, რომელიც შეიცავს 0.01 მგ/მლ His-NT-PNP და 100 მგ/მლ NT, ინარჩუნებდა წინასწარ ინკუბირებული ნიმუშების საწყისი ფერმენტული აქტივობის 65%-ს (ნახ. 6b).გელი ხელუხლებელი დარჩა გაზომვის დროს (დამატებითი სურ. 10).
ფარდობითი ფლუორესცენციის ინტენსივობა His-NT-GFP (300 მგ/მლ) და ინვერსიული ფლაკონის გელატაციამდე და მის შემდეგ, რომელიც შეიცავს His-NT-GFP ჰიდროგელს (300 მგ/მლ) ხილულ და ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ.წერტილები აჩვენებს ინდივიდუალურ გაზომვებს (n = 3), შეცდომის ზოლები აჩვენებს სტანდარტულ გადახრას.საშუალო მნიშვნელობა ნაჩვენებია შეცდომის ზოლების ცენტრში.b PNP აქტივობა მიღებულ იქნა ფლუორომეტრიული ანალიზით ხსნარებისა და გელების გამოყენებით, რომლებიც შედგებოდა NT (100 მგ/მლ) და ნარევი, რომელიც შეიცავს 0.01 მგ/მლ his-NT-PNP და 100 მგ/მლ ახალი ტაივანის დოლარს.ჩანართი აჩვენებს ინვერსიულ ფლაკონს, რომელიც შეიცავს ჰიდროგელს, რომელიც შეიცავს His-NT-PNP (5 მმ მასშტაბის ბარი).
აქ ჩვენ ვახსენებთ ჰიდროგელების წარმოქმნას NT და სხვა რეკომბინანტული სპიდროინის პროტეინებიდან ცილის ხსნარის ინკუბაციით 37°C ტემპერატურაზე (სურათი 1).ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ გელაცია დაკავშირებულია α-სპირალის გადაქცევასთან β- ფენებად და ამილოიდის მსგავსი ფიბრილების წარმოქმნასთან (ნახ. 3 და 4).ეს დასკვნა გასაკვირია, რადგან NT-ები არის დახვეული გლობულური ხუთჰელიქსიანი შეკვრა, რომლებიც ცნობილია მათი უკიდურესად მაღალი ხსნადობით და მაღალი სტაბილურობით კონცენტრაციებში >200 მგ/მლ 4°C-ზე რამდენიმე დღის განმავლობაში27.გარდა ამისა, NT-ები ადვილად იკეცება სითბოს დენატურაციის შემდეგ ცილის დაბალი კონცენტრაციით μM-ში.ჩვენი შედეგების მიხედვით, ფიბრილების ფორმირება მოითხოვს >10 მგ/მლ ცილის კონცენტრაციისა და ოდნავ ამაღლებული ტემპერატურის კომბინაციას (ნახ. 1).ეს შეესაბამება იმ აზრს, რომ ამილოიდური ფიბრილები შეიძლება წარმოიქმნას გლობულურად დაკეცილი ცილებისგან, რომლებიც ნაწილობრივ გაშლილ მდგომარეობაში არიან ფიზიოლოგიურ პირობებში თერმული რყევების გამო 48 .ცილების მაგალითები, რომლებიც განიცდიან ამ გარდაქმნას, მოიცავს ინსულინი49,50, β2-მიკროგლობულინი, ტრანსთირეტინი და ლიზოზიმი51,52,53.მიუხედავად იმისა, რომ NT არის α-სპირალი თავის მშობლიურ მდგომარეობაში, პოლიპეპტიდური ჯაჭვის დაახლოებით 65% თავსებადია სტერილური ელვის ფორმირებით (ნახ. 4e) 45 .ვინაიდან მონომერი დინამიურად მოძრავია46, მას შეუძლია გამოავლინოს ეს პოტენციური ამილოიდოგენური რეგიონები ზომიერად ამაღლებულ ტემპერატურაზე და მთლიანი ცილის მაღალი კონცენტრაციით შეიძლება მიაღწიოს კრიტიკულ კონცენტრაციას ამილოიდური ფიბრილის წარმოქმნისთვის54.ამ მსჯელობის შემდეგ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ნეგატიური კორელაცია სპიდროინის კონცენტრაციასა და გელაციის დროს შორის (ნახ. 1c), და თუ მონომერული NT კონფორმაცია სტაბილიზირებულია მუტაციებით (NT*, His-NT-L6) ან მარილის დამატებით, შეიძლება თავიდან აიცილოს ფორმირების ჰიდროგელები (სურ. 5).
უმეტეს შემთხვევაში, ამილოიდური ფიბრილები ქრება ხსნარიდან ნალექის სახით, მაგრამ გარკვეულ პირობებში მათ შეუძლიათ შექმნან ჰიდროგელები55,56,57.ჰიდროგელის წარმომქმნელ ფიბრილებს, როგორც წესი, აქვთ მაღალი ასპექტის თანაფარდობა და ქმნიან სტაბილურ სამგანზომილებიან ქსელებს მოლეკულური ჩახლართულების მეშვეობით, 55,58 შეესაბამება ჩვენს შედეგებს.ჰიდროგელის წარმოქმნისთვის in vitro, ცილები ხშირად მთლიანად ან ნაწილობრივ იშლება, მაგალითად, ორგანული გამხსნელების ზემოქმედებით, მაღალი ტემპერატურის (70-90°C) და/ან დაბალი pH (1.5-3.0) 59,60,61,62.აქ აღწერილი სპიდროინის ჰიდროგელი არ საჭიროებს მკაცრ დამუშავებას და არც ჯვარედინი დამაკავშირებელ აგენტებს ჰიდროგელების სტაბილიზაციისთვის.
ადრე იყო მოხსენებული, რომ სპიდროინი მეორდება და QD-ები, რომლებიც, როგორც ჩანს, განიცდიან β-ფურცლის შეცვლას აბრეშუმის დაწნვის დროს, ქმნიან ჰიდროგელს.ჩვენს აღმოჩენებთან შედარებით, ინკუბაციის დრო და/ან ინკუბაციური ტემპერატურა იყო მნიშვნელოვნად უფრო გრძელი ან უფრო მაღალი, შესაბამისად, და მიღებული ჰიდროგელი ხშირად იყო გაუმჭვირვალე (სურათი 7 და დამატებითი ცხრილი 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. გარდა სწრაფი გელის გამრავლებისა, NT ჰიდროგელები >300 მგ/მლ (30%) აღემატებოდა ყველა სხვა აღწერილი რეკომბინანტული ობობის აბრეშუმის ცილის ჰიდროგელს, ისევე როგორც ბუნებრივ ჰიდროგელს, როგორიცაა ჟელატინი, ალგინატი (2%), აგარი (0.5%). ) და კოლაგენი.(0.6%) (სურათი 7 და დამატებითი ცხრილები 1 და 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
ამ კვლევაში ჰიდროგელების გელის დრო და ელასტიურობის მოდული შედარებულია სხვა სპიდროინზე დაფუძნებულ ჰიდროგელებთან და შერჩეულ ბუნებრივ ჰიდროგელებთან.ცნობები მოცემულია გელატაციის პირობების აღწერასთან ერთად.APS ამონიუმის პერსულფატი, ოთახის ტემპერატურა.მონაცემები 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
როგორც ჩანს, ობობებმა შეიმუშავეს გზები, რათა თავიდან აიცილონ სპიდროინის გელი შენახვის დროს.მიუხედავად ცილის მაღალი კონცენტრაციისა აბრეშუმის ჯირკვალში, დიდი განმეორებითი რეგიონი, რომელიც დაკავშირებულია ტერმინალურ დომენთან, ნიშნავს, რომ NT და CT აშკარა კონცენტრაცია ჯირკვალში შეესაბამება დაახლოებით 10-20 მგ/მლ, ამ კვლევის საზღვარზე.საჭიროა in vitro დაკვირვებული ჰიდროგელის ფორმირებისთვის.გარდა ამისა, მარილების მსგავსი კონცენტრაცია 16 ასტაბილურებს NT, როგორც აბრეშუმის ჯირკვლებში (ნახ. 5b).NT კონფორმაცია შესწავლილია E. coli ციტოზოლში და აღმოჩნდა უფრო მჭიდროდ დაკეცილი, ვიდრე ინ ვიტრო გამოკვლევისას, რაც კიდევ უფრო მიუთითებს, რომ მარილი ან სხვა ფაქტორები ხელს უშლის მის აგრეგაციას in vivo.თუმცა, NT-ების უნარი გარდაიქმნება β-ფურცლის ბოჭკოებად, შესაძლოა მნიშვნელოვანი იყოს ძაფის ფორმირებისთვის და უნდა იყოს გამოკვლეული მომავალ კვლევებში.
გარდა NT-ამილოიდის მსგავსი ფიბრილისა და ჰიდროგელის წარმოქმნის ახალი ასპექტებისა, რომლებიც დაფიქსირდა ამ კვლევაში, ჩვენ ასევე ვაჩვენებთ, რომ ამ ფენომენს შეიძლება ჰქონდეს ბიოტექნოლოგიური და ბიოსამედიცინო გამოყენება (ნახ. 8).როგორც კონცეფციის დადასტურება, ჩვენ გავაერთიანეთ NT GFP ან PNP და ვაჩვენეთ, რომ შერწყმა ცილა ასევე აყალიბებს ჰიდროგელებს 37 °C-ზე ინკუბაციისას და რომ GFP და PNP ფრაქციები დიდწილად ინარჩუნებენ აქტივობას გელაციის შემდეგ (სურათი 6).ნუკლეოზიდური ფოსფორილაზები წარმოადგენს ნუკლეოზიდის ანალოგების სინთეზის მნიშვნელოვან კატალიზატორებს75, რაც ჩვენს აღმოჩენას რელევანტურს ხდის ბიოფარმაცევტულ ინდუსტრიაში.შერწყმის ცილების გამოხატვის კონცეფცია, რომლებიც ქმნიან გამჭვირვალე ჰიდროგელებს ხელსაყრელ პირობებში, საშუალებას იძლევა შექმნას ფუნქციონალიზებული ჰიდროგელები ხელსაყრელი თვისებებით ფართო სპექტრისთვის, როგორიცაა ფერმენტის იმობილიზაცია, წამლის კონტროლირებადი გამოშვება და ქსოვილის ინჟინერია.გარდა ამისა, NT და NT* არის ეფექტური გამოხატვის მარკერები30, რაც ნიშნავს, რომ NT და მისი ვარიანტები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ხსნადი შერწყმის ცილების მაღალი გამტარუნარიანობის წარმოებისთვის და შემდგომში იმობილიზებული სამიზნე ცილების შესაქმნელად 3D ჰიდროგელებში.
NT არის ხსნადი, α-სპირალი და სტაბილური დაბალ კონცენტრაციებში (μM) და 37°C.იმავე ტემპერატურაზე, მაგრამ მზარდი კონცენტრაციით (>10 მგ/მლ), NT წარმოქმნის გელებს, რომლებიც შედგება ამილოიდის მსგავსი ფიბრილებისაგან.NT შერწყმა პროტეინები ასევე ქმნიან ფიბრილარულ გელებს სრულად ფუნქციონალური შერწყმის ფრაგმენტებით, რაც საშუალებას აძლევს სხვადასხვა ცილებს იმობილიზაციას 3D ჰიდროგელებში NT-ის გამოყენებით.ქვედა: NT (PDB: 4FBS) და ბოჭკოვანი ქსელების და ასოცირებული ცილის სტრუქტურების ილუსტრაციები (ვარაუდი და არ არის შედგენილი მასშტაბით, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd21).
კონსტრუქტები (იხ. დამატებითი ცხრილი 4 სრული სიისთვის ამინომჟავების თანმიმდევრობების ჩათვლით) კლონირებულ იქნა პლაზმიდში pT7 და გარდაიქმნა E. coli BL21 (DE3).E. coli-ის შემცველი ინჟინერიული პლაზმიდები დათესეს ლურიას ბულიონში, რომელსაც დაემატა კანამიცინი (70 მგ/ლ) და გაიზარდა ღამით 30°C-ზე და 250 rpm-ზე.შემდეგ კულტურა ინოკულირებული იყო 1/100 LB გარემოში, რომელიც შეიცავს კანამიცინს და კულტივირებული იყო 30°C-ზე და 110 rpm-ზე, სანამ OD600 არ მიაღწევდა 0.8-ს.NMR კვლევებისთვის, ბაქტერიები გაიზარდა M9 მინიმალურ გარემოში, რომელიც შეიცავს 2 გ D-გლუკოზა 13C (ოლდრიჩი) და 1 გ ამონიუმის ქლორიდს 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ცილების იზოტოპებით მარკირებისთვის.დაწიეთ ტემპერატურა 20 გრადუს ცელსიუსამდე და პროტეინის ექსპრესიის ინდუქცია 0.15 მმ იზოპროპილთიოგალაქტოპირანოზიდით (საბოლოო კონცენტრაცია).ღამის ცილის ექსპრესიის შემდეგ, უჯრედები აღებული იქნა 7278 × გ, 4°C 20 წუთის განმავლობაში.უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 20 მმ ტრის-HCl-ში, pH 8 და გაიყინა შემდგომ გამოყენებამდე.გალღობილი უჯრედები ლიზირებული იყო უჯრედის დამრღვევის გამოყენებით (TS სერიის მანქანები, Constant Systems Limited, ინგლისი) 30 კპა-ზე.შემდეგ ლიზატები ცენტრიფუგირებულ იქნა 25000 გ-ზე 30 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.NTMiSp-სთვის, მარცვლები ხელახლა გააჩერეს 2 M შარდოვანაში, 20 მმ Tris-HCl, pH 8, და გაჟღენთილი 2 წუთის განმავლობაში (2 წმ ჩართვა/გამორთვა, 65%), შემდეგ კვლავ ცენტრიფუგირებულ იქნა 25000 xg, 4°C ფარგლებში. 30 წთ.სუპერნატანტი ჩატვირთეს Ni-NTA სვეტზე, გარეცხეს 20 მმ ტრის-HCl, 2 მმ იმიდაზოლით, pH 8, და ბოლოს ცილა გამორეცხეს 20 მმ ტრის-HCl, 200 მმ იმიდაზოლით, pH 8. NT2RepCT და გენერირება. NTCT, თრომბინის მონელება იწვევს ადგილს (ThrCleav) მის და NT-ს შორის.თრომბინის დაშლის ადგილები ასევე არის His-NT-ThrCleav-2Rep (წარმოქმნის 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (აწარმოებს NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (აწარმოებს CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (აწარმოებს NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (აწარმოებს NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (აწარმოებს NTF1Sp) და His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (აწარმოებს).კონსტრუქციები დაიჯესტირდა თრომბინით (1:1000) და დიალიზებული იქნა ღამით 4°C-ზე. 20 მმ Tris-HCl, pH 8, Spectra/Por დიალიზის მემბრანის გამოყენებით, მოლეკულური წონის ზღურბლით 6-8 kDa.დიალიზის შემდეგ, ხსნარი იტვირთება Ni-NTA სვეტზე და გროვდება გამონადენი, რომელიც შეიცავს ინტერესის პროტეინს.ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა UV შთანთქმის გაზომვით 280 ნმ-ზე თითოეული ცილის გაქრობის კოეფიციენტის გამოყენებით, გარდა NTF1Sp-ისა, რომელიც იყენებდა ბრედფორდის ანალიზს მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.სისუფთავე განისაზღვრა SDS პოლიაკრილამიდის (4–20%) გელის ელექტროფორეზით და Coomassie ბრწყინვალე ლურჯი შეღებვით.ცილები კონცენტრირებული იყო ცენტრიფუგის ფილტრების გამოყენებით (VivaSpin 20, GE Healthcare) 4000 xg 10 kDa მოლეკულური წონის შეწყვეტით 20 წუთიანი ციკლით.
გაალღვეთ ცილის ხსნარი და ფრთხილად გადაიტანეთ 150 μl 1 მლ გამჭვირვალე ძგიდის ფლაკონში (8 x 40 მმ Thermo Scientific).მილები დაიხურა და დალუქული პარაფილმით აორთქლების თავიდან ასაცილებლად.ნიმუშები (n = 3) ინკუბირებული იყო 37°C ან 60°C ტემპერატურაზე და პერიოდულად ინვერსიული იყო გელატაციის დასაკვირვებლად.ნიმუშები, რომლებიც არ იყო გელი, ინკუბირებული იყო მინიმუმ ერთი კვირის განმავლობაში.შეამცირეთ NTMiSp დისულფიდური ბმები 10 მმ DTT 10 μM პროტეინზე.ობობის ბუნებრივი აბრეშუმის საფარის გელაციის გასაანალიზებლად, შვედური ხიდის ობობა მოიჭრა, ორი ძირითადი ამპულირებული ჯირკვალი მოათავსეს 200 μl 20 mM Tris-HCl ბუფერში pH 8 და გაჭრა, რათა საფარი გამოეყო ჯირკვლებისგან..ჯირკვლების შიგთავსი იხსნება ბუფერში, 50 μl მშრალი წონის დასადგენად (ღია ფლაკონების ინკუბაციით 60 °C მუდმივ წონამდე) და 150 μl ჟელაციისთვის 37 °C-ზე.
საზომი გეომეტრია/ხელსაწყო დამზადებულია უჟანგავი ფოლადისგან, პარალელური ფირფიტის გამოყენებით, ზედა დიამეტრით 20 მმ და უფსკრული 0,5 მმ.გააცხელეთ ნიმუში 25 °C-დან 45 °C-მდე და უკან 25 °C-მდე 1 °C წუთში სიჩქარით, უჟანგავი ფოლადის ქვედა პელტიეს ფირფიტის გამოყენებით.ვიბრაციული გაზომვები ჩატარდა 0,1 ჰც სიხშირეზე და მასალის ხაზოვან ვისკოელასტიურ რეგიონში 5% და 0,5% ძაბვით 100 მგ/მლ და 300-500 მგ/მლ ნიმუშებისთვის, შესაბამისად.გამოიყენეთ მორგებული ტენიანობის კამერა აორთქლების თავიდან ასაცილებლად.მონაცემები გაანალიზებულია Prism 9-ის გამოყენებით.
ინფრაწითელი (IR) სპექტრების შეგროვებისთვის ოთახის ტემპერატურაზე 800-დან 3900 სმ-1-მდე.ATR მოწყობილობა, ისევე როგორც სინათლის ბილიკი სპექტრომეტრით, იწმინდება მშრალი გაფილტრული ჰაერით ექსპერიმენტამდე და მის დროს.ხსნარები (500 მგ/მლ, სპექტრებში წყლის შთანთქმის პიკების შესამცირებლად) პიპეტით გადაიტანეს კრისტალებზე და გელები (500 მგ/მლ) წარმოიქმნა გაზომვამდე და შემდეგ გადაიტანეს კრისტალებში (n = 3).დაფიქსირდა 1000 სკანირება 2 სმ-1 გარჩევადობით და ნულოვანი სამუშაო ციკლი 2. მეორე წარმოებული გამოითვალა OPUS-ის (Bruker) გამოყენებით ცხრა წერტილის დამარბილებელი დიაპაზონის გამოყენებით.სპექტრები ნორმალიზებული იყო იმავე ინტეგრაციის რეგიონში 1720-დან 1580 სმ-1-მდე F. Menges-ის გამოყენებით "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".ATR-IR სპექტროსკოპიაში, ინფრაწითელი სხივის შეღწევის სიღრმე ნიმუშში დამოკიდებულია ტალღის რაოდენობაზე, რაც იწვევს უფრო ძლიერ შთანთქმას ქვედა ტალღურ რიცხვებში, ვიდრე უფრო მაღალი ტალღების რიცხვებში.ეს ეფექტები არ არის გამოსწორებული ნახ.3 რადგან ისინი ძალიან მცირეა (დამატებითი სურ. 4).ამ ფიგურისთვის შესწორებული სპექტრები გამოითვალა Bruker OPUS პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
პრინციპში, ცილების კონფორმაციების ყოვლისმომცველი რაოდენობრივი განსაზღვრა შესაძლებელია კომპონენტების საიმედო დეკონვოლუციის შემდეგ ამიდის I პიკში.თუმცა, პრაქტიკაში გარკვეული დაბრკოლებები წარმოიქმნება.ხმაური სპექტრში შეიძლება გამოჩნდეს (ცრუ) პიკების სახით დეკონვოლუციის დროს.გარდა ამისა, წყლის მოღუნვის გამო პიკი ემთხვევა ამიდის I მწვერვალის პოზიციას და შეიძლება ჰქონდეს მსგავსი სიდიდე დიდი რაოდენობით წყლის შემცველ ნიმუშებზე, როგორიცაა აქ შესწავლილი წყლის გელი.აქედან გამომდინარე, ჩვენ არ ვცდილობდით ამიდური I პიკის სრულად დაშლას და ჩვენი დაკვირვებები უნდა ჩაითვალოს მხოლოდ სხვა მეთოდების მხარდასაჭერად, როგორიცაა NMR სპექტროსკოპია.
50 მგ/მლ NT და His-NT2RepCT ხსნარები ჟელდებოდა ღამით 37°C-ზე.შემდეგ ჰიდროგელი განზავებულია 20 მმ ტრის-HCl-ით (pH 8) კონცენტრაციამდე 12,5 მგ/მლ, კარგად შეანჯღრიეთ და პიპეტით გატეხეს გელის გასატეხად.შემდეგ, ჰიდროგელი განზავებული იქნა 10-ჯერ 20 მმ ტრის-HCl-ით (pH 8), ნიმუშის 5 მკლ გადაიტანეს სპილენძის ბადეზე, რომელიც დაფარული იყო ფორმირებით და ჭარბი ნიმუში ამოღებულ იქნა ბლოტი ქაღალდით.ნიმუშები ორჯერ გარეცხეს 5 მკლ MilliQ წყლით და შეღებეს 1% ურანილის ფორმატით 5 წუთის განმავლობაში.მოიშორეთ ზედმეტი ლაქა შთამნთქმელი ქაღალდით, შემდეგ გააშრეთ ბადე ჰაერზე.ამ ბადეებზე გამოსახულება განხორციელდა FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN-ის გამოყენებით, რომელიც მუშაობს 100 კვ.სურათები ჩაწერილი იყო x 26,500 და x 43,000 გადიდებით Veleta 2k × 2k CCD კამერის გამოყენებით (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, გერმანია).თითოეული ნიმუშისთვის (n = 1) ჩაიწერა 10-15 სურათი.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) გამოიყენებოდა გამოსახულების ანალიზისა და ბოჭკოების დიამეტრის გასაზომად (n = 100, სხვადასხვა ბოჭკო).პრიზმა 9 გამოიყენებოდა დაუწყვილებელი t-ტესტების შესასრულებლად (ორკუდიანი).საშუალო His-NT2RepCT და NT ფიბრილები იყო 11.43 (SD 2.035) და 7.67 (SD 1.389) ნმ, შესაბამისად.ნდობის ინტერვალი (95%) არის -4.246-დან -3.275-მდე.თავისუფლების ხარისხი = 198, p <0,0001.
80 μl თხევადი ნიმუშები, რომლებიც შეიცავდა 10 μM თიოფლავინ T (ThT) გაზომეს სამჯერ (n = 3) სტატიკური პირობებში Corning 96 ჭაბურღილის შავი ფსკერის გამჭვირვალე ფსკერის ფირფიტების გამოყენებით (Corning Glass 3881, აშშ).ფლუორესცენციის განსხვავებები დაფიქსირდა 440 ნმ აგზნების ფილტრის და 480 ნმ ემისიის ფილტრის გამოყენებით (FLUOStar Galaxy BMG Labtech-ისგან, ოფენბურგი, გერმანია).ThT სიგნალი არც გაჯერებული იყო და არც ჩაქრა, რადგან ThT-ის სხვადასხვა კონცენტრაციით ექსპერიმენტები ჩატარდა სიგნალის ინტენსივობის შეცვლის გარეშე.ჩაწერეთ შთანთქმა 360 ნმ-ზე ნისლის გაზომვისთვის.დათესვის ექსპერიმენტებისთვის, 100 მგ/მლ გელები ჩამოყალიბდა 37°C-ზე, ხელახლა შეჩერდა და გამოიყენებოდა დათესვისთვის 5%, 10% და 20% მოლური თანაფარდობით.მონაცემები გაანალიზებულია Prism 9-ის გამოყენებით.
გაალღვეთ His-NT2RepCT და NT >100 მგ/მლ ყინულზე და გაფილტრეთ 0,22 მკმ ფილტრის მეშვეობით.კონცენტრაციები გამოითვალა შთანთქმის გაზომვით 280 ნმ-ზე Nanodrop-ის გამოყენებით.96 ჭაბურღილიანი შავი არასავალდებულო ფირფიტის ჭაბურღილში (Corning) გამჭვირვალე ფსკერით, ნიმუშები განზავებული იყო 20 მგ/მლ-მდე 20 მმ Tris-HCl pH 8-ში და შერეული იყო 5 μM ThT-ით (საბოლოო კონცენტრაცია), ნიმუშის მთლიანი კონცენტრაცია. მოცულობა 50 მლ.ნიმუშები იღებებოდა ყოველ 10 წუთში 37 °C ტემპერატურაზე CellObserver (Zeiss) მიკროსკოპზე გადაცემული სინათლის არხით და FITC აგზნების და ემისიის ფილტრების კომპლექტით ThT გამოსახულების მისაღებად.გამოსახულების მისაღებად გამოიყენება 20x/0.4 ობიექტივი.გამოსახულების ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა Zen Blue (Zeiss) და ImageJ (https://imagej.nih.gov/).გელები ასევე მომზადდა NT და His-NT2RepCT ხსნარებისგან 50 მგ/მლ კონცენტრაციით, რომელიც შეიცავს 20 მმ Tris pH 8 და 5 μM ThT და ინკუბირებული იყო 37°C-ზე 90 წუთის განმავლობაში.გელის ნაჭრები გადატანილი იქნა ახალ ჭაბურღილში, რომელიც შეიცავდა 20 მმ ტრისს, pH 8 და 5 μM ThT-ს არასავალდებულო შავი 96 ჭაბურღილების გამჭვირვალე ქვედა ფირფიტაში.მიიღეთ მწვანე ფლუორესცენციის და ნათელი ველის სურათები 20x/0.4 გადიდებით.გამოსახულების ანალიზისთვის გამოიყენეს ImageJ.
ხსნარის NMR სპექტრები მიღებულ იქნა 310 K-ზე 600 MHz Bruker Avance Neo სპექტრომეტრზე, რომელიც აღჭურვილია QCI ოთხპოლუსიანი რეზონანსული პულსირებული გრადიენტური ველის კრიოზონდით (HFCN).NMR ნიმუშები, რომლებიც შეიცავს 10 მგ/მლ ჰომოგენურ პროტეინს, ეტიკეტირებული 13C, 15N, გახსნილი 20 მმ Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .NT2RepCT-ის ქიმიური ძვრები pH 6.7-ზე გამოყენებული იყო პიკის 23-ის მინიჭებისთვის 15N-HSQC 2D სპექტრში.
ჯადოსნური კუთხით დატრიალებული მყარი NMR (MAS) სპექტრები 13C, 15N-ზე მარკირებული ჰიდროგელები დაფიქსირდა Bruker Avance III HD სპექტრომეტრზე 800 MHz-ზე, რომელიც აღჭურვილია 3.2 მმ 13C/15N{1H} უელექტრონული ზონდით.ნიმუშის ტემპერატურა კონტროლდებოდა ცვლადი ტემპერატურის გაზის ნაკადის გამოყენებით 277 K. ორგანზომილებიანი დიპოლური ბრუნვის რეზონანსული (DARR)76 და რადიოსიხშირული ხელახალი დაკავშირების (RFDR)77 სპექტრები მიღებული იყო MAS სიხშირეებზე 12.5 kHz და 20 kHz, შესაბამისად.ჯვარედინი პოლარიზაცია (CP) 1H-დან 13C-მდე განხორციელდა ხაზოვანი რამპის გამოყენებით 60.0-დან 48.0 kHz-მდე 1H-ზე, 61.3/71.6 kHz 13C-ზე (12.5/20 kHz MAS-ზე) და კონტაქტის დრო 0.5-1 ms.მონაცემების შეგროვებისას გამოყენებული იქნა Spinal6478 გამოყოფა 73.5 kHz-ზე.შეძენის დრო იყო 10 მილიწამი, ხოლო ციკლის დაგვიანება იყო 2,5 წამი.RFDR სპექტრებში დაფიქსირებული ერთჯერადი Ca/Cβ კორელაციები მინიჭებული იყო დამახასიათებელი ნარჩენის ტიპის ქიმიური ძვრებისა და DARR სპექტრებში გამრავლებით დაკავშირებული კორელაციების საფუძველზე.
Zipper79 მონაცემთა ბაზა (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) გამოყენებული იყო ფრიალის ტენდენციებისა და როზეტას ენერგიის შესაფასებლად NT, NTFlSp და NTMiSp.Zipper მონაცემთა ბაზაში გამოითვლება Rosetta Energy80, რომელიც აერთიანებს რამდენიმე უფასო ენერგიის ფუნქციას ცილის სტრუქტურის მოდელირებისთვის და ანალიზისთვის.ენერგიის დონე -23 კკალ/მოლი ან უფრო დაბალი მიუთითებს ფიბრილაციის მაღალ ტენდენციაზე.დაბალი ენერგია ნიშნავს ორი β-სტრიქონის მეტ სტაბილურობას ელვის კონფორმაციაში.გარდა ამისა, ვალსის ალგორითმი გამოიყენებოდა ამილოიდოგენური რეგიონების პროგნოზირებისთვის NT, NTFlSp და NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT ცილის ხსნარი შერეული იყო 2-(N-მორფოლინო)ეთანსულფონის მჟავას (MES) ბუფერთან pH 5.5 და 6.0 pH-ის დასაწევად, შესაბამისად, pH 6 და 7-მდე.ცილის საბოლოო კონცენტრაცია იყო 100 მგ/მლ.
გაზომვები ჩატარდა J-1500 CD სპექტრომეტრზე (JASCO, აშშ) 300 μL კუვეტის გამოყენებით ოპტიკური ბილიკით 0,1 სმ.პროტეინები განზავებული იყო 10 μM-მდე (n = 1) 20 მმ ფოსფატის ბუფერში (pH 8).მარილის თანდასწრებით ცილის სტაბილურობის გასაანალიზებლად, ცილები გაანალიზდა იმავე კონცენტრაციით (n = 1) 20 მმ ფოსფატის ბუფერში (pH 8), რომელიც შეიცავს 154 მმ NaF ან NaCl, შესაბამისად.ტემპერატურის სკანირება დაფიქსირდა 222 ნმ-ზე 25°C-დან 95°C-მდე გათბობის სიჩქარით 1°C/წთ.ბუნებრივად დაკეცილი ცილების პროპორცია გამოითვალა ფორმულით (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).გარდა ამისა, ხუთი სპექტრი დაფიქსირდა თითოეული ნიმუშისთვის 260 ნმ-დან 190 ნმ-მდე 25°C-ზე და 95°C-მდე გაცხელების შემდეგ.ხუთი სპექტრი იყო საშუალოდ, გათლილი და გადაკეთდა მოლარულ ელიფტიურობაში.მონაცემები გაანალიზებულია Prism 9-ის გამოყენებით.
His-NT-GFP-ის ფლუორესცენციის ინტენსივობა (300 მგ/მლ, 80 μL) გაზომილი იყო სამჯერ (n = 3) 96 ჭაბურღილების კორნინგის ფირფიტებში შავი გამჭვირვალე ფსკერით (Corning Glass 3881, აშშ) სტატიკური პირობებში.გაზომეთ ნიმუშები ფლუორესცენტზე დაფუძნებული ფირფიტის მკითხველით აგზნების ტალღის სიგრძით 395 ნმ და ჩაწერეთ ემისია 509 ნმ-ზე გელაციამდე და 2 საათის შემდეგ 37°C ტემპერატურაზე.მონაცემები გაანალიზებულია Prism 9-ით.
პურინის ნუკლეოზიდის ფოსფორილაზას აქტივობის საანალიზო ნაკრები (ფლუორომეტრიული მეთოდი, Sigma Aldrich) გამოყენებული იყო მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.აქტივობის გასაზომად გელებსა და ხსნარებში, რომლებიც შეიცავს His-NT-PNP, შეურიეთ 10 ნგ His-NT-PNP 100 მგ/მლ NT-ს საერთო მოცულობამდე 2 μL, რადგან გელი აძლევდა სიგნალს ნაკრების გამოვლენის ინტერვალის ზემოთ.ჩართული იყო გელებისა და ხსნარების კონტროლი His-NT-PNP-ის გარეშე.გაზომვები ჩატარდა ორჯერ (n = 2).აქტივობის გაზომვის შემდეგ, სარეაქციო ნარევი ამოიღეს და გელი გადაიღეს, რათა უზრუნველყოფილიყო, რომ გელი ხელუხლებელი დარჩენილიყო გაზომვის დროს.მონაცემები გაანალიზებულია Prism 9-ის გამოყენებით.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ბუნების კვლევის აბსტრაქტი, რომელიც დაკავშირებულია ამ სტატიასთან.
1 და 2 სურათებზე მოცემულია საწყისი მონაცემები.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, და 6, დამატებითი ნახ.3, დამატებითი ნახ.5a, d, დამატებითი ნახ.6 და დამატებითი ნახ.8. მონაცემები ამ კვლევის მონაცემები განთავსებულია Zenodo მონაცემთა ბაზაში https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.ამ კვლევაში მიღებული NMR მონაცემები გამოქვეყნდა BMRBig საცავში ჩანაწერის ID bmrbig36-ით.GFP და PNP სტრუქტურები აღებულია PDB-დან (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Spinning ხელოვნური ობობის აბრეშუმი.ეროვნული ქიმიური.ბიოლოგია.11, 309–315 (2015).
Babb, PL და სხვ.Nephila clavipes-ის გენომი ხაზს უსვამს ობობის აბრეშუმის გენების მრავალფეროვნებას და მათ რთულ გამოხატულებას.ეროვნული გენეტი.49, 895–903 (2017).