347 12.7*1.24 მმ უჟანგავი ფოლადის დახვეული მილები, α-სინუკლეინისა და ტაუს სინქრონული ელექტროსტატიკური კონდენსაციისა და კოაგრეგაციის მოლეკულური მექანიზმი

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
სლაიდერები, რომლებიც აჩვენებს სამ სტატიას თითო სლაიდზე.გამოიყენეთ უკანა და შემდეგი ღილაკები სლაიდებში გადასაადგილებლად, ან სლაიდის კონტროლერის ღილაკები ბოლოს თითოეულ სლაიდში გადასაადგილებლად.

347 უჟანგავი ფოლადის მილების სპეციფიკაცია

347 12.7*1.24მმ უჟანგავი ფოლადის დახვეული მილები

გარე დიამეტრი: 6.00 მმ OD მდე 914.4 მმ OD, ზომები 24 ინჩამდე NB ხელმისაწვდომია ყოფილი მარაგში, OD ზომა ფოლადის მილები ხელმისაწვდომია ყოფილი მარაგში

SS 347 მილის სისქის დიაპაზონი: 0.3 მმ – 50 მმ, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S და ა.შ. (0.5-12 მმ) ან არარეგულარული ზომა მორგებული საჭიროებისამებრ

ტიპი: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW მილები |SS 347 შედუღებული მილები |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW მილები, LSAW მილები / შედუღებული / შედუღებული

ფორმა: SS 347 მრგვალი მილები/მილები, SS 347 კვადრატული მილები/მილები, SS 347 მართკუთხა მილები/მილები, SS 347 დახვეული მილები, SS 347 „U“ ფორმა, SS 347 პან ტორტის ხვეულები, SS 347 ჰიდრავლიკური მილები

სიგრძე: ერთჯერადი შემთხვევითი, ორმაგი შემთხვევითი & საჭირო სიგრძე დასასრული: უბრალო ბოლო, დახრილი ბოლო, დახრილი

ბოლო დაცვა: პლასტიკური ქუდები |გარე დასრულება: 2B, No.4, No.1, No.8 სარკის დასრულება უჟანგავი ფოლადის მილებისთვის, დასრულება მომხმარებლის მოთხოვნების შესაბამისად

მიწოდების პირობა: გახეხილი და მწნილი, გაპრიალებული, ნათელი ანეილი, ცივი დახატული

ინსპექტირება, ტესტის ანგარიშები: წისქვილის ტესტის სერთიფიკატები, EN 10204 3.1, ქიმიური ანგარიშები, მექანიკური ანგარიშები, PMI ტესტის ანგარიშები, ვიზუალური ინსპექტირების ანგარიშები, მესამე მხარის ინსპექტირების ანგარიშები, NABL დამტკიცებული ლაბორატორიის ანგარიშები, დესტრუქციული ტესტის ანგარიში, არა დესტრუქციული ტესტის ანგარიშები

შეფუთვა: შეფუთულია ხის ყუთებში, პლასტმასის ჩანთებში, ფოლადის ზოლებში შეფუთული, ან მომხმარებელთა მოთხოვნის მიხედვით

სპეციალობები: ზომები და სპეციფიკაციები, გარდა ზემოთ აღნიშნულისა, შეიძლება დამზადდეს მოთხოვნით

SS 347 მილის ზომის დიაპაზონი: 1/2 ინჩი NB, OD-დან 24 ინჩამდე

ASTM A312 347: უწყვეტი და სწორი ნაკერიანი შედუღებული ავსტენიტური მილი, რომელიც განკუთვნილია მაღალი ტემპერატურისა და ზოგადი კოროზიული მომსახურებისთვის.შემავსებელი ლითონის დაუშვებელია შედუღების დროს.

ASTM A358 347: ელექტრო შედუღებით შედუღებული ავსტენიტური მილი კოროზიული და/ან მაღალი ტემპერატურის მომსახურებისთვის.როგორც წესი, ამ სპეციფიკაციით იწარმოება მხოლოდ 8 დიუმამდე მილი.შედუღების დროს დასაშვებია შემავსებლის ლითონის დამატება.

ASTM A790 347: უწყვეტი და სწორი ნაკერიანი შედუღებული ფერიტური/აუსტენიტური (დუპლექსური) მილი, რომელიც განკუთვნილია ზოგადი კოროზიული მომსახურებისთვის, განსაკუთრებული აქცენტით სტრესული კოროზიის დაბზარვისადმი წინააღმდეგობის გაწევით.

ASTM A409 347: სწორი ან სპირალურ-ნაკერიანი ელექტრო შედუღებით შედუღებული დიდი დიამეტრის ავსტენიტური მსუბუქი კედლის მილი 14"-დან 30"-მდე ზომით Sch5S და Sch 10S კედლებით კოროზიული და/ან მაღალი

ASTM A376 347: უწყვეტი ავსტენიტური მილი მაღალი ტემპერატურის გამოყენებისთვის.

ASTM A813 347: ერთნაკერიანი, ერთჯერადი ან ორმაგი შედუღებული აუსტინიტური მილი მაღალი ტემპერატურისა და ზოგადი კოროზიული გამოყენებისთვის.

ASTM A814 347: ცივად დამუშავებული შედუღებული ავსტენიტური მილი მაღალი ტემპერატურისა და ზოგადი კოროზიული მომსახურებისთვის.

347H უჟანგავი ფოლადის მილები ქიმიური შემადგენლობა

უჟანგავი ფოლადის 347H მილის მექანიკური თვისებები

უჟანგავი ფოლადის 347H მილები ფიზიკური თვისებები

ექვივალენტური კლასები 347H უჟანგავი ფოლადის მილისთვის

ამილოიდური ალფა-სინუკლეინის (αS) აგრეგაცია პარკინსონის დაავადების და სხვა სინუკლეინოპათიების დამახასიათებელი ნიშანია.ცოტა ხნის წინ, ალცჰეიმერის დაავადებასთან ჩვეულებრივ ასოცირებული tau ცილა ასოცირებულია αS პათოლოგიასთან და აღმოჩნდა, რომ ის თანალოკალიზებულია αS-ით მდიდარ ჩანართებში, თუმცა ორი ცილის კოაგრეგაციის მოლეკულური მექანიზმი გაურკვეველი რჩება.ჩვენ აქ ვატყობთ, რომ αS ფაზა იყოფა თხევად კონდენსატებად ელექტროსტატიკური კომპლექსური კონდენსაციის გზით დადებითად დამუხტული პოლიპეპტიდებით, როგორიცაა ტაუ.პოლიკატიონებთან αS-ის აფინურობისა და კოაგულაციის ქსელის ვალენტურობის დაქვეითების სიჩქარის მიხედვით, კოლტები განიცდის სწრაფ გელაციას ან შერწყმას, რასაც მოჰყვება ნელი ამილოიდური აგრეგაცია.მოწინავე ბიოფიზიკური ტექნიკის ნაკრების კომბინაციით, ჩვენ შევძელით თხევადი-თხევადი αS/Tau ფაზის გამოყოფის დახასიათება და ძირითადი ფაქტორების იდენტიფიცირება, რომლებიც იწვევს ჰეტეროგენული აგრეგატების ფორმირებას, რომლებიც შეიცავს ორივე ცილას თხევადი ცილის კონდენსატში.
მემბრანული განყოფილებების გარდა, უჯრედებში სივრცითი განცალკევება ასევე შეიძლება მიღწეული იყოს ცილებით მდიდარი, თხევადი მსგავსი მკვრივი სხეულების წარმოქმნით, რომელსაც ეწოდება ბიომოლეკულური კონდენსატები ან წვეთები, პროცესის მეშვეობით, რომელიც ცნობილია როგორც თხევადი-თხევადი ფაზის გამოყოფა (LLPS).ეს წვეთები წარმოიქმნება მრავალვალენტიანი დროებითი ურთიერთქმედებით, როგორც წესი, ცილებს ან ცილებსა და რნმ-ს შორის და ემსახურება სხვადასხვა ფუნქციებს თითქმის ყველა ცოცხალ სისტემაში.LLP-ის მქონე პროტეინების დიდი რაოდენობა ავლენს დაბალი სირთულის თანმიმდევრობებს, რომლებიც ბუნებით უაღრესად მოუწესრიგებელია და ბიომოლეკულური კონდენსატების ფორმირებაში3,4,5.მრავალრიცხოვანმა ექსპერიმენტულმა კვლევამ გამოავლინა ცილების მოქნილი, ხშირად მოუწესრიგებელი და მრავალვალენტიანი ბუნება, რომლებიც ქმნიან ამ თხევადი კონდენსატებს, თუმცა ცოტა რამ არის ცნობილი კონკრეტული მოლეკულური დეტერმინანტების შესახებ, რომლებიც აკონტროლებენ ამ კონდენსატების ზრდას და მომწიფებას უფრო მყარ მსგავს კონდენსატამდე. სახელმწიფო..
ახალი მონაცემები მხარს უჭერს ჰიპოთეზას, რომ ცილებით გამოწვეული LLPS და წვეთების გადაქცევა მყარ სტრუქტურებად შეიძლება იყოს შესაბამისი უჯრედული გზები, რომლებიც მიგვიყვანს უხსნადი ტოქსიკური აგრეგატების წარმოქმნამდე, რომლებიც ხშირად დეგენერაციული დაავადებების დამახასიათებელი ნიშნებია.ბევრი LLPS-თან ასოცირებული არსებითად უწესრიგო ცილა (IDPs), ხშირად ძალიან დამუხტული და მოქნილი, დიდი ხანია დაკავშირებულია ნეიროდეგენერაციასთან ამილოიდური აგრეგაციის პროცესში.კერძოდ, ბიომოლეკულური IDP კონდენსატები, როგორიცაა FUS7 ან TDP-438 ან ცილები დიდი დაბალი სირთულის დომენებით, როგორიცაა hnRNPA19, ნაჩვენებია, რომ ბერდება გელის მსგავს ან თუნდაც მყარ ფორმებში, პროცესის საშუალებით, რომელსაც ეწოდება თხევადი.ნაერთი.მყარი ფაზის გადასვლამდე (LSPT) დროის ფუნქციით ან გარკვეული პოსტტრანსლაციური ცვლილებების ან პათოლოგიურად მნიშვნელოვანი მუტაციების საპასუხოდ1,7.
კიდევ ერთი დევნილი, რომელიც დაკავშირებულია LLPS in vivo-თან არის Tau, მიკროტუბულებთან ასოცირებული უწესრიგო ცილა, რომლის ამილოიდური აგრეგაცია ჩართული იყო ალცჰეიმერის დაავადებაში10, მაგრამ ასევე ახლახან ჩართული იყო პარკინსონის დაავადებაში (PD) და დაკავშირებული სხვა სინაფსური ბირთვული პროტეინოპათიების 11, 12, 13.ნაჩვენებია, რომ ტაუ სპონტანურად იშლება ხსნარიდან/ციტოპლაზმიდან ხელსაყრელი ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების გამო14, რის შედეგადაც წარმოიქმნება ტაუ-გამდიდრებული წვეთები, რომლებიც ცნობილია როგორც ელექტროსტატიკური კოაცერვატები.ასევე დაფიქსირდა, რომ ამ ტიპის არასპეციფიკური ურთიერთქმედება არის მამოძრავებელი ძალა ბუნებაში არსებული მრავალი ბიომოლეკულური კონდენსატის უკან15.ტაუ პროტეინის შემთხვევაში, ელექტროსტატიკური აგრეგაცია შეიძლება წარმოიქმნას მარტივი აგრეგაციით, რომელშიც ცილის საპირისპიროდ დამუხტული რეგიონები იწვევენ დაშლის პროცესს, ან რთული აგრეგაციის გზით უარყოფითად დამუხტულ პოლიმერებთან, როგორიცაა რნმ.
ახლახან, α-სინუკლეინი (αS), ამილოიდი IDP, რომელიც მონაწილეობს PD-ში და სხვა ნეიროდეგენერაციულ დაავადებებში, რომლებიც ერთობლივად ცნობილია როგორც სინუკლეინოპათია17,18, ნაჩვენებია ფიჭურ და ცხოველურ მოდელებში19,20 კონცენტრირებული ცილის კონდენსატებში სითხის მსგავსი ქცევით.In vitro კვლევებმა აჩვენა, რომ αS განიცდის LLPS-ს მარტივი აგრეგაციის გზით უპირატესად ჰიდროფობიური ურთიერთქმედების გზით, თუმცა ეს პროცესი მოითხოვს ცილების განსაკუთრებულად მაღალ კონცენტრაციებს და ატიპიურად ხანგრძლივ ინკუბაციურ პერიოდებს19,21.გადაუჭრელ საკითხად რჩება თუ არა αS შემცველი კონდენსატები, რომლებიც შეინიშნება in vivo, წარმოიქმნება თუ არა ამ ან სხვა LLPS პროცესებით.ანალოგიურად, მიუხედავად იმისა, რომ αS ამილოიდის აგრეგაცია დაფიქსირდა ნეირონებში PD და სხვა სინუკლეინოპათიებში, ზუსტი მექანიზმი, რომლითაც αS განიცდის უჯრედშიდა ამილოიდის აგრეგაციას, გაურკვეველი რჩება, რადგან ამ ცილის გადაჭარბებული გამოხატვა თავისთავად არ იწვევს ამ პროცესს.ხშირად საჭიროა უჯრედების დამატებითი დაზიანება, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ უჯრედშიდა ამილოიდური შეკრებების რენუკლეაციისთვის საჭიროა გარკვეული უჯრედული მდებარეობა ან მიკროგარემო.ერთი ფიჭური გარემო, რომელიც განსაკუთრებით მიდრეკილია აგრეგაციისკენ, შეიძლება იყოს ცილის კონდენსატების შიდა 23.
საინტერესოა, რომ αS და tau თანალოკალიზებულია პარკინსონის დაავადებისა და სხვა სინუკლეინოპათიების მქონე ადამიანებში დამახასიათებელ დაავადების ჩართვაში 24,25 და ექსპერიმენტებმა დააფიქსირა სინერგიული პათოლოგიური კავშირი ორ ცილას შორის 26,27, რაც ვარაუდობს პოტენციურ კავშირს αS და აგრეგაციას შორის. ტაუ ნეიროდეგენერაციულ დაავადებებში.დაავადება.აღმოჩნდა, რომ αS და tau ურთიერთქმედებენ და ხელს უწყობენ ერთმანეთის აგრეგაციას in vitro და in vivo 28,29 და ამ ორი ცილისგან შემდგარი ჰეტეროგენული აგრეგატები დაფიქსირდა სინუკლეინოპათიის მქონე პაციენტების ტვინში 30 .თუმცა, ცოტა რამ არის ცნობილი αS-სა და ტაუს შორის ურთიერთქმედების მოლეკულური საფუძვლისა და მისი კოაგრეგაციის მექანიზმის შესახებ.ცნობილია, რომ αS ურთიერთქმედებს ტაუსთან ელექტროსტატიკური მიზიდულობის მეშვეობით αS-ის უაღრესად უარყოფითად დამუხტულ C-ტერმინალურ რეგიონსა და ტაუს ცენტრალურ პროლინით მდიდარ რეგიონს შორის, რომელიც ასევე გამდიდრებულია დადებითად დამუხტული ნარჩენებით.
ამ კვლევაში ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ αS-ს მართლაც შეუძლია დაიშალა წვეთებად ელექტროსტატიკური კომპლექსური კონდენსაციის გზით ტაუ ცილის თანდასწრებით, განსხვავებით მისი ურთიერთქმედებისგან სხვა დადებითად დამუხტულ პოლიპეპტიდებთან, როგორიცაა პოლი-L-ლიზინი (pLK) და ამ პროცესში .αS მოქმედებს როგორც ხარაჩოს ​​მოლეკულა წვეთოვანი ქსელისთვის.ჩვენ გამოვავლინეთ შესამჩნევი განსხვავებები ელექტროსტატიკური αS კოაცერვატების მომწიფების პროცესში, რაც დაკავშირებულია კოაცერვატის ქსელში ჩართული ცილების ურთიერთქმედების ვალენტობასა და სიძლიერესთან.საინტერესოა, რომ ჩვენ დავაკვირდით αS და ტაუ ამილოიდური პროტეინების კოაგრეგაციას ხანგრძლივ თხევად კოაცერვატებში და გამოვავლინეთ რამდენიმე ძირითადი ფაქტორი, რომელიც იწვევს ამ ორი ცილის კოაგრეგაციას ასეთ კოაცერვატებში.აქ ჩვენ დეტალურად აღვწერთ ამ პროცესს, რომელიც არის შესაძლო მოლეკულური მექანიზმი, რომელიც ეფუძნება ორი ცილის კოლოკალიზაციას დაავადების სპეციფიკურ ჩანართებში.
αS-ს აქვს უაღრესად ანიონური C-ტერმინალური კუდი ნეიტრალურ pH-ზე (ნახ. 1a) და ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ მას შეეძლო დაექვემდებაროს LLPS ელექტროსტატიკური კომპლექსების კონდენსაციის გზით პოლიკატიონური უწესრიგო პოლიპეპტიდური მოლეკულებით.ჩვენ გამოვიყენეთ 100 ნარჩენი პოლი-L-ლიზინი (pLK), როგორც საწყისი მოდელის მოლეკულა მისი დადებითად დამუხტული და მოუწესრიგებელი პოლიმერული ბუნების გამო ნეიტრალურ pH 32-ზე. პირველი, ჩვენ დავადასტურეთ, რომ pLK ურთიერთქმედებს αS-ის Ct დომენთან Solution NMR სპექტროსკოპიით. (სურათი 1b) 13C/15N-ის მარკირებული αS-ის გამოყენებით αS:pLK მოლარული თანაფარდობების გაზრდის თანდასწრებით.pLK-ის ურთიერთქმედება αS-ის Ct დომენთან გამოიხატება ქიმიური ცვლის დარღვევაში და ცილის ამ რეგიონში პიკური ინტენსივობის დაქვეითებით.საინტერესოა, როდესაც ჩვენ შევურიეთ αS pLK-ს αS კონცენტრაციით დაახლ.5-25 μM პოლიეთილენ გლიკოლის (5-15% PEG-8) თანდასწრებით (ტიპიური LLPS ბუფერი: 10 მმ HEPES pH 7.4, 100 მმ NaCl, 15% PEG-8) ჩვენ მაშინვე გავიარეთ ცილების წარმოქმნის ფართო ველი. .წვეთები დაფიქსირდა ფლუორესცენციის (WF) და ნათელი ველის (BF) მიკროსკოპის გამოყენებით (ნახ. 1c).1-5 მკმ წვეთები, რომლებიც შეიცავს კონცენტრირებულ αS-ს (დამატებულია 1 μM AlexaFluor488-ის მარკირებული αS, AF488-αS), მათი ელექტროსტატიკური თვისებები შეიძლება გამოწვეული იყოს 10% 1,6-ჰექსანდიოლის (1,6-HD) წინააღმდეგობისა და მისი მგრძნობელობისგან. NaCl კონცენტრაციის ზრდა (ნახ. 1c).αS/pLK ელექტროსტატიკური კომპლექსის კოაცერვატების სითხის მსგავსი ბუნება ნაჩვენებია მათი მილიწამებში შერწყმის უნარით (ნახ. 1დ).ტურბიდიმეტრიის გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ წვეთების წარმოქმნა ამ პირობებში, დავადასტურეთ ძირითადი ურთიერთქმედების ელექტროსტატიკური ბუნება, რომელიც დაკავშირებულია მის სტაბილურობასთან (ნახ. 1e) და შევაფასეთ სხვადასხვა პოლიმერული კოეფიციენტების გავლენა LLPS პროცესზე (ნახ. 1f).მიუხედავად იმისა, რომ წვეთების ფორმირება შეინიშნება პოლიმერების თანაფარდობის ფართო დიაპაზონში, პროცესი ძალიან ხელსაყრელია, როდესაც pLK აღემატება αS-ს.LLP-ები ასევე დაფიქსირდა ქიმიურად განსხვავებული გადამტანი აგენტის დექსტრან-70 (70 kDa) გამოყენებით ან სხვადასხვა ნიმუშის ფორმატების გამოყენებით, მათ შორის შუშის სლაიდების წვეთები, სხვადასხვა მასალის მიკროფირფიტის ჭაბურღილები, ეპენდორფის ან კვარცის კაპილარები.
სხვადასხვა ცილის რეგიონების სქემატური წარმოდგენა WT-αS და ΔCt-αS ვარიანტებში, რომლებიც გამოიყენება ამ კვლევაში.ამფიპათიური N-ტერმინალური დომენი, ჰიდროფობიური ამილოიდის წარმომქმნელი რეგიონი (NAC) და უარყოფითად დამუხტული C-ტერმინალური დომენი ნაჩვენებია, შესაბამისად, ლურჯი, ნარინჯისფერი და წითელი.ნაჩვენებია WT-αS-ის წმინდა გადასახადი ნარჩენებზე (NCPR).b αS/pLK ურთიერთქმედების NMR ანალიზი მაკრომოლეკულური გროვების არარსებობის შემთხვევაში.როგორც pLK კონცენტრაცია იზრდება (αS:pLK მოლარული თანაფარდობები 1:0.5, 1:1.5 და 1:10 ნაჩვენებია ღია მწვანე, მწვანე და მუქი მწვანე ფერებით, შესაბამისად).c Coacervate αS/pLK (მოლური თანაფარდობა 1:10) 25 μM-ზე (1 μM AF488-ზე ეტიკეტირებული αS ან Atto647N-ის მარკირებული pLK WF გამოსახულების მიზნით) LLPS ბუფერში (ზემოდან) ან დაემატება 500 მმ NaCl (ქვემოდან მარცხნივ) ან 10-ის შემდეგ. % 1,6-ჰექსანდიოლი (1,6-HD; ქვედა მარჯვნივ).მასშტაბის ზოლი = 20 μm.d αS/pLK-ის BF წვეთოვანი შერწყმის წარმომადგენლობითი მიკროსკოპული გამოსახულებები (მოლური თანაფარდობა 1:10) 25 μM კონცენტრაციით;ისრები მიუთითებს ცალკეული წვეთების შერწყმას (წითელი და ყვითელი ისრები) ახალ წვეთად (ნარინჯისფერი ისარი) 200 ms-ში).მასშტაბის ზოლი = 20 μm.e სინათლის გაფანტვა (350 ნმ-ზე) αS/pLK აგრეგაცია LLPS ბუფერში 500 მმ NaCl ან 10% 1,6-HD 25 μM αS-ზე დამატების წინ და შემდეგ (N = 3 ნიმუშის გამეორება, საშუალო და სტანდარტული გადახრა ასევე მითითებულია).f BF გამოსახულება (ზემოდან) და სინათლის გაფანტვის ანალიზი (350 ნმ, ქვედა) αS/pLK აგრეგაციის 25 μM αS-ზე αS:pLK მოლარული თანაფარდობის გაზრდით (N = 3 ნიმუშის გამეორება, საშუალო და სტანდარტული გადახრა ასევე მითითებულია).მასშტაბის ზოლი = 10 μm.მასშტაბის ზოლი ერთ სურათზე მიუთითებს ყველა სურათის მასშტაბს ერთ პანელზე.ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
αS/pLK ელექტროსტატიკური კომპლექსის კონდენსაციაზე და წინა დაკვირვებებზე αS-ზე, როგორც tau/RNA კონდენსატის კლიენტის მოლეკულაზე დაყრდნობით tau31-თან პირდაპირი ურთიერთქმედების გზით, ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ αS და tau შეიძლება თანაგამოყოფა გამხსნელთან რნმ-ის არარსებობის შემთხვევაში. კონდენსაცია.ელექტროსტატიკური კომპლექსების მეშვეობით, და αS არის ხარაჩოს ​​ცილა αS/Tau coacervates-ში (იხ. tau მუხტის განაწილება სურათზე 2e).ჩვენ დავაკვირდით, რომ როდესაც 10 μM αS და 10 μM Tau441 (შეიცავდა 1 μM AF488-αS და 1 μM Atto647N-Tau, შესაბამისად) ერთმანეთში აირია LLPS ბუფერში, ისინი ადვილად წარმოქმნიდნენ ცილოვან აგრეგატებს, რომლებიც შეიცავდნენ ორივე ცილას, როგორც ჩანს WF მიკროსკოპით.(ნახ. 2ა).ორი ცილის კოლოკალიზაცია წვეთებში დადასტურდა კონფოკალური (CF) მიკროსკოპით (დამატებითი სურ. 1a).მსგავსი ქცევა დაფიქსირდა, როდესაც დექსტრან-70 გამოიყენებოდა აგრეგაციის აგენტად (დამატებითი სურ. 1c).FITC ეტიკეტირებული PEG-ის ან დექსტრანის გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ორივე შემავსებელი აგენტი თანაბრად იყო განაწილებული ნიმუშებზე, არ აჩვენებს არც სეგრეგაციას და არც ასოციაციას (დამატებითი სურათი 1d).უფრო მეტიც, ის ვარაუდობს, რომ ამ სისტემაში ისინი ხელს უწყობენ ფაზების განცალკევებას მაკრომოლეკულური დაგროვების ეფექტების მეშვეობით, ვინაიდან PEG არის უპირატესად სტაბილური შეკრების აგენტი, როგორც ეს სხვა LLP სისტემებში ჩანს33,34.ეს ცილებით მდიდარი წვეთები მგრძნობიარე იყო NaCl-ის (1 M) მიმართ, მაგრამ არა 1,6-HD (10% ვ/ვ) მიმართ, რაც ადასტურებს მათ ელექტროსტატიკურ თვისებებს (დამატებითი სურ. 2a, b).მათი სითხის ქცევა დადასტურდა წვეთების შერწყმის მილიწამში დაკვირვებით BF მიკროსკოპის გამოყენებით (ნახ. 2b).
αS/Tau441-ის კონფოკალური (CF) მიკროსკოპული გამოსახულებები კოაცერვატდება LLPS ბუფერში (თითოეული ცილა 10 μM, AF488-ით ეტიკეტირებული αS 0,5 μM და Atto647N მარკირებული Tau441).b αS/Tau441 წვეთოვანი შერწყმის მოვლენების წარმომადგენლობითი დიფერენციალური ჩარევის კონტრასტის (DIC) სურათები (10 μM თითოეული ცილისთვის).c ფაზის დიაგრამა, რომელიც დაფუძნებულია Tau441 LLPS (0–15 μM) სინათლის გაბნევაზე (350 ნმ) 50 μM αS არარსებობის (მარცხნივ) ან (მარჯვნივ) არსებობის შემთხვევაში.თბილი ფერები მიუთითებს უფრო გაფანტულობაზე.d αS/Tau441 LLPS ნიმუშების სინათლის გაფანტვა αS კონცენტრაციის გაზრდით (Tau441 5 μM-ზე, N = 2–3 ნიმუშის გამეორება, როგორც მითითებულია).e ამ კვლევაში გამოყენებული ტაუ პროტეინის ზოგიერთი ვარიანტისა და ცილის სხვადასხვა რეგიონის სქემატური წარმოდგენა: უარყოფითად დამუხტული N-ტერმინალური დომენი (წითელი), პროლინით მდიდარი რეგიონი (ლურჯი), მიკროტუბულების დამაკავშირებელი დომენი (MTBD, ხაზგასმულია ნარინჯისფრად) და ამილოიდის შემქმნელი წყვილი სპირალი.ძაფის რეგიონები (PHF), რომლებიც მდებარეობს MTBD-ში (ნაცრისფერი).ნაჩვენებია Tau441-ის წმინდა გადასახადი ნარჩენებზე (NCPR).f 1 μM AF488-ით ეტიკეტირებული αS და Atto647N ეტიკეტირებული ΔNt-, 1 μM AF488-იანი αS ან ΔCt-αS გამოყენებით ΔNt-Tau (ზედა, 10 μM თითო ცილაზე) ან K18 (ქვედა, 50 μM თითო ცილაზე) თანდასწრებით ) ) ) WF-ის მიკროგრაფები შედედებული LLPS ან K18 ბუფერში.მასშტაბის ზოლები ერთ სურათზე წარმოადგენს ყველა სურათის მასშტაბს ერთ პანელში (20 μm პანელებისთვის a, b და f).ნედლეული მონაცემები პანელებისთვის c და d მოწოდებულია როგორც ნედლეული მონაცემთა ფაილები.
αS-ის როლის შესამოწმებლად ამ LLPS პროცესში, ჩვენ პირველად გამოვიკვლიეთ αS-ის ეფექტი წვეთების სტაბილურობაზე ნეფელომეტრიით NaCl-ის მზარდი კონცენტრაციების გამოყენებით (ნახ. 2c).რაც უფრო მაღალია მარილის კონცენტრაცია αS-ის შემცველ ნიმუშებში, მით უფრო მაღალია სინათლის გაფანტვის მნიშვნელობები (350 ნმ), რაც მიუთითებს αS-ის სტაბილიზაციის როლზე ამ LLPS სისტემაში.მსგავსი ეფექტი შეიძლება შეინიშნოს αS კონცენტრაციის (და შესაბამისად αS:Tau441 თანაფარდობის) გაზრდით დაახლ.10-ჯერ ზრდა ტაუს კონცენტრაციასთან შედარებით (5 μM) (ნახ. 2d).იმის დემონსტრირებისთვის, რომ αS არის ხარაჩოს ​​ცილა კოცერვატებში, ჩვენ გადავწყვიტეთ გამოგვეკვლია LLPS-ით დაზიანებული Tau მუტანტის ქცევა, რომელსაც აკლია უარყოფითად დამუხტული N-ტერმინალური რეგიონი (ნარჩენები 1–150, იხ. ნახ. 2e), სახელწოდებით ΔNt-Tau.WF მიკროსკოპამ და ნეფელომეტრიამ დაადასტურა, რომ ΔNt-Tau თავად არ გაივლიდა LLPS (ნახ. 2f და დამატებითი ნახ. 2d), როგორც ადრე იყო მოხსენებული 14. თუმცა, როდესაც αS დაემატა ამ შეკვეცილი Tau ვარიანტის დისპერსიულ ხსნარებს, LLPS პროცესი მთლიანად დასრულდა. აღდგენილია წვეთოვანი სიმკვრივით Tau-ს და αS-ის სრული ზომის ხსნარების წვეთების სიმკვრივესთან მსგავს პირობებში და ცილის კონცენტრაციებში.ეს პროცესი ასევე შეიძლება შეინიშნოს დაბალი მაკრომოლეკულური ხალხმრავლობის პირობებში (დამატებითი სურ. 2c).C-ტერმინალური αS რეგიონის როლი, მაგრამ არა მთელი მისი სიგრძე, LLPS პროცესში ნაჩვენები იყო წვეთების წარმოქმნის ინჰიბირებით C-ტერმინალური შეკვეცილი αS ვარიანტის გამოყენებით, რომელსაც აკლია ნარჩენები 104-140 (ნახ. 1a) (ΔCt-). αS) ცილა (ნახ. 2f და დამატებითი ნახ. 2დ).αS და ΔNt-Tau-ის კოლოკალიზაცია დადასტურდა კონფოკალური ფლუორესცენტული მიკროსკოპით (დამატებითი სურ. 1b).
LLPS მექანიზმის შემდგომი შესამოწმებლად Tau441-სა და αS-ს შორის, გამოყენებული იქნა Tau-ს დამატებითი ვარიანტი, კერძოდ, დაწყვილებული სპირალური ძაფის ბირთვი (PHF) ფრაგმენტი მიკროტუბულების შემაკავშირებელ დომენში (MTBD), რომელიც, თუ შეიცავს ოთხ დამახასიათებელ განმეორებით დომენს, რომელიც ასევე ცნობილია. როგორც K18 ფრაგმენტი (იხ. სურ. 2e).ახლახან გავრცელდა ინფორმაცია, რომ αS უპირატესად აკავშირებს ტაუ პროტეინს, რომელიც მდებარეობს პროლინით მდიდარ დომენში, თანმიმდევრობით, რომელიც წინ უსწრებს მიკროტუბულების შემაკავშირებელ დომენს.თუმცა, PHF რეგიონი ასევე მდიდარია დადებითად დამუხტული ნარჩენებით (იხ. ნახაზი 2e), განსაკუთრებით ლიზინი (15% ნარჩენები), რამაც გვიბიძგა დაგვემოწმებინა თუ არა ეს რეგიონი ასევე ხელს უწყობს αS/Tau კომპლექსის კონდენსაციას.ჩვენ დავაკვირდით, რომ მხოლოდ K18-ს არ შეეძლო LLPS-ის გააქტიურება 100 μM-მდე კონცენტრაციებში შემოწმებულ პირობებში (LLPS ბუფერი 15% PEG ან 20% დექსტრანი) (სურათი 2f).თუმცა, როდესაც ჩვენ დავამატეთ 50 μM αS 50 μM K18-ს, K18 და αS შემცველი ცილის წვეთების სწრაფი წარმოქმნა დაფიქსირდა ნეფელომეტრიით (დამატებითი სურათი 2d) და WF მიკროსკოპით (ნახ. 2f).როგორც მოსალოდნელი იყო, ΔCt-αS-მა ვერ შეძლო K18-ის LLPS ქცევის აღდგენა (ნახ. 2f).ჩვენ აღვნიშნავთ, რომ αS/K18 აგრეგაციას სჭირდება ოდნავ უფრო მაღალი ცილის კონცენტრაცია LLPS-ის გამოწვევისთვის αS/ΔNt-Tau ან αS/Tau441-თან შედარებით, სხვა თანაბარი პირობებით.ეს შეესაბამება αS C-ტერმინალური რეგიონის უფრო ძლიერ ურთიერთქმედებას პროლინით მდიდარ Tau დომენთან შედარებით მიკროტუბულების დამაკავშირებელ დომენთან, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი 31 .
იმის გათვალისწინებით, რომ ΔNt-Tau არ შეუძლია შეასრულოს LLPS αS-ის არარსებობის შემთხვევაში, ჩვენ ავირჩიეთ ეს Tau ვარიანტი, როგორც მოდელი αS/Tau LLPS-ის დასახასიათებლად, მისი სიმარტივის გათვალისწინებით LLPS სისტემებში სრულმეტრაჟიანი Tau (იზოტიპი, Tau441/Tau441).რთული (ჰეტეროტიპული, αS/Tau441) აგრეგაციის პროცესებით.ჩვენ შევადარეთ αS აგრეგაციის ხარისხი (როგორც შედედებული ფაზის პროტეინის ნაწილი, fαS,c) αS/Tau და αS/ΔNt-Tau სისტემებში ცენტრიფუგირებისა და დისპერსიული ფაზის SDS-PAGE ანალიზით (იხ. 2e), აღმოვაჩინეთ ძალიან მსგავსი მნიშვნელობები. ყველა ცილისთვის ერთნაირი კონცენტრაციით.კერძოდ, მივიღეთ fαS,c 84 ± 2% და 79 ± 7% αS/Tau და αS/ΔNt-Tau-სთვის, შესაბამისად, რაც ვარაუდობს, რომ αS და tau-ს შორის ჰეტეროტიპული ურთიერთქმედება აღემატება ტაუს მოლეკულებს შორის ურთიერთქმედებას.შორის.
ურთიერთქმედება სხვადასხვა პოლიკატიონებთან და კონდენსაციის პროცესის ეფექტი αS კინეტიკაზე პირველად იქნა შესწავლილი ფლუორესცენციის აღდგენის შემდეგ ფოტოგათეთრების (FRAP) მეთოდით.ჩვენ გამოვცადეთ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau და αS/pLK კოაცერვატები (100 μM αS დამატებული 2 μM αS AF488-αS და 100 μM Tau441 ან ΔNt-Tau ან 1 mM pLK).მონაცემები მიღებული იქნა ნიმუშის კომპონენტების შერევიდან პირველი 30 წუთის განმავლობაში.წარმომადგენლობითი FRAP გამოსახულებებიდან (ნახ. 3a, αS/Tau441 კონდენსაცია) და მათი შესაბამისი დროის კურსის მოსახვევებიდან (ნახ. 3b, დამატებითი ნახ. 3), ჩანს, რომ αS კინეტიკა ძალიან ჰგავს Tau441 კოაცერვატებს.და ΔNt-Tau, რომელიც ბევრად უფრო სწრაფია pLK-ით.გამოთვლილი დიფუზიის კოეფიციენტები αS-სთვის კოაცერვატის შიგნით FRAP-ის მიხედვით (როგორც აღწერილია Kang et al. 35) არის D = 0,013 ± 0,009 μm2/s და D = 0,026 ± 0,008 μm2/s αS/Tau441-სთვის და αS/. αS/ სისტემა.pLK, Tau და D = 0,18 ± 0,04 μm2/s, შესაბამისად (ნახ. 3c).თუმცა, დიფუზიის კოეფიციენტი αS დისპერსიულ ფაზაში არის რამდენიმე რიგით მაღალი, ვიდრე ყველა შედედებული ფაზა, როგორც ეს განისაზღვრება ფლუორესცენციის კორელაციური სპექტროსკოპიით (FCS, იხილეთ დამატებითი სურათი 3) იმავე პირობებში (LLPS ბუფერი), მაგრამ პოლიკატიონების არარსებობის შემთხვევაში. (D = 8 ± 4 μm2/s).ამიტომ, αS ტრანსლაციის კინეტიკა მნიშვნელოვნად შემცირებულია კოაცერვატებში ცილებთან შედარებით დისპერსიულ ფაზაში მკვეთრად გამოხატული მოლეკულური დაგროვების ეფექტების გამო, თუმცა ყველა კოაცერვატი ინარჩუნებს სითხის მსგავს თვისებებს წარმოქმნიდან პირველი ნახევარი საათის განმავლობაში, განსხვავებით ტაუს ფაზისგან.უფრო სწრაფი კინეტიკა pLK კონდენსატში.
a–c FRAP ანალიზი αS დინამიკის (2% AF488-ის მარკირებული αS) ელექტროსტატიკური კოაცერვატებში.αS/Tau441 FRAP ანალიზების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები სამჯერ ნაჩვენებია (a), სადაც წითელი წრეები მიუთითებს გაუფერულ ადგილებზე.მასშტაბის ზოლი არის 5 μm.b საშუალო FRAP მრუდები და (გ) გაანგარიშებული დიფუზიის კოეფიციენტები (D) 5-6 (N) სხვადასხვა წვეთისთვის სამი ექსპერიმენტიდან 100 μM αS და Tau441 (წითელი) ან ΔNt-Tau (ლურჯი) ან pLK (მწვანე) გამოყენებით ექვიმოლური კონცენტრაციით. ათჯერ მეტი LLPS-ის კონცენტრაციით.FRAP მრუდის სტანდარტული გადახრა ნაჩვენებია დაჩრდილულ ფერში.შედარებისთვის, დიფუზიის კოეფიციენტი αS დისპერსიულ ფაზაში განისაზღვრა სამჯერ ფლუორესცენციის კორელაციური სპექტროსკოპიის (FCS) გამოყენებით (იხილეთ დამატებითი სურათი 3 და მეთოდები დამატებითი ინფორმაციისთვის).d უწყვეტი X-ზოლის EPR სპექტრები 100 μM TEMPOL-122-αS LLPS ბუფერში ყოველგვარი პოლიკატირების გარეშე (შავი) ან 100 μM Tau441 (წითელი) ან ΔNt-Tau (ლურჯი) ან 1 mM pLK (მწვანე) თანდასწრებით.ჩანართი აჩვენებს ძლიერი ველის ხაზების გადიდებულ ხედს, სადაც ხდება ყველაზე დრამატული ცვლილებები.e 50 μM TEMPOL-122-αS-ის დამაკავშირებელი მრუდები სხვადასხვა პოლიკატიონებით LLPS-ის არარსებობის შემთხვევაში (PEG-ის გარეშე).III ჯგუფის შემცირებული ამპლიტუდა ნორმალიზებული EPR სპექტრის II (IIII/III) ჯგუფთან შედარებით ნაჩვენებია Tau441 (წითელი), ΔNt-Tau (ლურჯი) და pLK (მწვანე) მოლარული თანაფარდობების გაზრდის მიზნით.ფერადი ხაზები აჩვენებს მონაცემებს შეესაბამება უხეში შეკვრის მოდელის n იდენტური და დამოუკიდებელი შეკვრის ადგილით თითოეულ მრუდზე.ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
როგორც დამატებით, ჩვენ გამოვიკვლიეთ αS-ის დინამიკა სხვადასხვა კოაცერვატებში მიმართული სპინის მარკირების (SDSL) და უწყვეტი ელექტრონული პარამაგნიტური რეზონანსის (CW-EPR) გამოყენებით.ეს მეთოდი ძალიან სასარგებლო აღმოჩნდა იძულებით გადაადგილებული პირის მოქნილობისა და დინამიკის შესახებ რეალისტური ნარჩენი რეზოლუციით36,37,38.ამ მიზნით, ჩვენ ავაშენეთ ცისტეინის ნარჩენები ერთ Cys მუტანტებში და გამოვიყენეთ 4-ჰიდროქსი-2,2,6,6-ტეტრამეთილპიპერიდინ-N-ოქსილის (TEMPOL) სპინის ზონდი.მალეიმიდის წარმოებულები მათ ეტიკეტს აწერენ.უფრო კონკრეტულად, ჩვენ ჩავსვით TEMPOL ზონდები 122 ან 24 αS პოზიციაზე (TEMPOL-122-αS და TEMPOL-24-αS).პირველ შემთხვევაში, ჩვენ მიზანმიმართულია ცილის C-ტერმინალური რეგიონი, რომელიც მონაწილეობს პოლიკატიონებთან ურთიერთქმედებაში.ამის ნაცვლად, 24-ე პოზიციამ შეიძლება მოგვცეს ინფორმაცია კონდენსატის ცილების საერთო დინამიკის შესახებ.ორივე შემთხვევაში, დისპერსიული ფაზის ცილებისთვის მიღებული EPR სიგნალები შეესაბამებოდა ნიტროქსიდის რადიკალებს სწრაფად მოძრავ მდგომარეობაში.ფაზური გამოყოფის შემდეგ tau ან pLK-ის თანდასწრებით (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ან ΔNt-Tau თანაფარდობით 1:1 ან pLK 1:10 თანაფარდობით), დაფიქსირდა ფარდობითი პიკის ინტენსივობის ზრდა αS-ის EPR სპექტრი.დანაკარგის ხაზი გაფართოვდა, რაც მიუთითებს შემცირებულ αS-ის რეორიენტაციის კინეტიკაზე წვეთებში ცილებთან შედარებით განზავებულ ფაზაში (ნახ. 3d, დამატებითი ნახ. 4a).ეს ცვლილებები უფრო გამოხატულია 122-ე პოზიციაზე. მიუხედავად იმისა, რომ 24-ე პოზიციაზე pLK-ის არსებობა გავლენას არ ახდენდა ზონდის კინეტიკაზე, 122 პოზიციაზე სპექტრული ხაზის ფორმა მნიშვნელოვნად შეიცვალა (დამატებითი სურ. 4a).როდესაც ჩვენ ვცდილობდით სპექტრების მოდელირებას ორი αS/პოლიკაციის სისტემის 122 პოზიციაზე იზოტროპული მოდელის გამოყენებით (დამატებითი სურათი 5a), რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება სპინით მარკირებული IDP38,39 დინამიკის აღსაწერად, ჩვენ ვერ შევძელით ექსპერიმენტული სპექტრების რეკონსტრუქცია..24 სპინის კონტრასტის პოზიციის სპექტრული სიმულაცია (დამატებითი სურ. 5a).ეს ვარაუდობს, რომ არსებობს შეღავათიანი პოზიციები αS-ის C-ტერმინალური რეგიონის სპინის კონფიგურაციების სივრცეში პოლიკატიონების არსებობისას.შედედებულ ფაზაში αS-ის ფრაქციის განხილვისას ექსპერიმენტული EPR-ის პირობებში (84 ± 2%, 79 ± 7%, და 47 ± 4% αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau და αS/pLK, შესაბამისად - იხ. დამატებითი გ. მონაცემთა ანალიზის ნახ. 2e, ჩანს, რომ EPR მეთოდით გამოვლენილი გაფართოება ძირითადად ასახავს αS-ის C-ტერმინალური რეგიონის ურთიერთქმედებას სხვადასხვა პოლიკატიონებთან შედედებულ ფაზაში (ძირითადი ცვლილება TEMPOL-122- გამოყენებისას. αS), და არა ცილის კონდენსაცია.ზონდში შეინიშნება მიკრობლანტის ზრდა.როგორც მოსალოდნელი იყო, ცილის EPR სპექტრი LLPS-ის გარდა სხვა პირობებში მთლიანად აღდგა, როდესაც ნარევს დაემატა 1 M NaCl (დამატებითი სურ. 4b).საერთო ჯამში, ჩვენი მონაცემები ვარაუდობს, რომ CW-EPR-ის მიერ გამოვლენილი ცვლილებები ძირითადად ასახავს αS-ის C-ტერმინალური რეგიონის ურთიერთქმედებას სხვადასხვა პოლიკატიონებთან შედედებულ ფაზაში და ეს ურთიერთქმედება, როგორც ჩანს, უფრო ძლიერია pLK-თან, ვიდრე Tau-სთან.
კოაცერვატის ცილების შესახებ მეტი სტრუქტურული ინფორმაციის მისაღებად, გადავწყვიტეთ შეგვესწავლა LLPS სისტემა ხსნარში NMR-ის გამოყენებით.თუმცა, ჩვენ შევძელით მხოლოდ დისპერსიულ ფაზაში დარჩენილი αS ფრაქციის გამოვლენა, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს ცილის შემცირებული დინამიკით კოაცერვატის შიგნით და მკვრივი ფაზა ხსნარის ბოლოში NMR ანალიზში.როდესაც გავაანალიზეთ LLPS ნიმუშის დისპერსიულ ფაზაში დარჩენილი ცილის სტრუქტურა და დინამიკა NMR-ის გამოყენებით (დამატებითი ნახ. 5c, d), ჩვენ შევამჩნიეთ, რომ ცილა თითქმის იდენტურად იქცეოდა pLK და ΔNt-Tau-ს თანდასწრებით, ორივე რომლებიც იმყოფებოდნენ ცილოვანი ხერხემლის მეორად სტრუქტურასა და დინამიკაში, გამოვლენილი ექსპერიმენტებით მეორად ქიმიურ ცვლაზე და R1ρ რელაქსაციაზე.NMR მონაცემები აჩვენებს, რომ αS-ის C-ბოლო განიცდის კონფორმაციული მოქნილობის მნიშვნელოვან დაკარგვას, ხოლო ინარჩუნებს თავის არეულ ბუნებას, ისევე როგორც დანარჩენი ცილის თანმიმდევრობას, პოლიკატიონებთან მისი ურთიერთქმედების გამო.
ვინაიდან CW-EPR სიგნალის გაფართოება, რომელიც დაფიქსირდა TEMPOL-122-αS შედედებულ ფაზაში, ასახავს ცილის ურთიერთქმედებას პოლიკატიონებთან, ჩვენ ჩავატარეთ EPR ტიტრაცია, რათა შეგვეფასებინა αS-ის შეკავშირება სხვადასხვა პოლიკატიონებთან LLPS-ის არარსებობის შემთხვევაში (დაგროვების გარეშე ბუფერული LLPS), ვარაუდობს, რომ ურთიერთქმედება ერთნაირია განზავებულ და კონცენტრირებულ ფაზებში (რაც დასტურდება ჩვენი მონაცემებით, დამატებითი სურ. 4a და დამატებითი ნახ. 6).მიზანი იყო იმის დანახვა, რომ ყველა კოაცერვატი, მიუხედავად მათი საერთო სითხის მსგავსი თვისებებისა, ავლენს თუ არა რაიმე ძირეულ დიფერენციალურ ქცევას მოლეკულურ დონეზე.როგორც მოსალოდნელი იყო, EPR სპექტრი გაფართოვდა პოლიკატიონის კონცენტრაციის მატებასთან ერთად, რაც ასახავს მოლეკულური მოქნილობის შემცირებას ყველა ურთიერთქმედების პარტნიორის მოლეკულური ურთიერთქმედების გამო თითქმის გაჯერებამდე (ნახ. 3e, დამატებითი ნახ. 6).pLK-მ მიაღწია ამ გაჯერებას უფრო დაბალი მოლარული თანაფარდობით (პოლიკაცია:αS) ΔNt-Tau და Tau441-თან შედარებით.ფაქტობრივად, მონაცემთა შედარება მიახლოებით შებოჭვის მოდელთან, რომელიც ვივარაუდებთ, რომ n იდენტური და დამოუკიდებელი შებოჭვის ადგილია, აჩვენა, რომ pLK-ის აშკარა დისოციაციის მუდმივი (~5 μM) არის სიდიდის რიგით დაბალი ვიდრე Tau441 ან ΔNt-Tau (~50 μM). ).μM).მიუხედავად იმისა, რომ ეს არის უხეში შეფასება, ეს ვარაუდობს, რომ αS-ს აქვს უფრო მაღალი მიდრეკილება უწყვეტი დადებითი მუხტის რეგიონებით მარტივი პოლიკათიონებისთვის.αS-სა და სხვადასხვა პოლიკატიონებს შორის აფინურობის ამ განსხვავების გათვალისწინებით, ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ მათი თხევადი თვისებები შეიძლება განსხვავებულად შეიცვალოს დროთა განმავლობაში და, შესაბამისად, განიცადოს სხვადასხვა LSPT პროცესები.
ცილის კოაცერვატის ძალიან ხალხმრავალი გარემოს და ცილის ამილოიდური ბუნების გათვალისწინებით, ჩვენ ვაკვირდებოდით კოაცერვატის ქცევას დროთა განმავლობაში LSPT შესაძლო პროცესების გამოსავლენად.BF და CF მიკროსკოპის გამოყენებით (სურათი 4), ჩვენ დავაფიქსირეთ, რომ αS/Tau441 ხსნარში დიდწილად ერწყმის და წარმოქმნის დიდ წვეთებს, რომლებიც ეკონტაქტებიან და ატენიანებენ ზედაპირს ჭაბურღილის/სრიალებს სრული წვეთების სახით, როგორც მოსალოდნელი იყო (დამატებითი ნახ. 7d);ჩვენ ვუწოდებთ ამ ქვედა ფორმირებულ სტრუქტურებს "პროტეინის რაფტებს".ეს სტრუქტურები რჩებოდა თხევად, რადგან მათ შეინარჩუნეს შერწყმის უნარი (დამატებითი სურ. 7b) და შეიძლება ნახულიყო რამდენიმე საათის განმავლობაში LLPS-ის გააქტიურებიდან (ნახ. 4 და დამატებითი ნახ. 7გ).ჩვენ დავაკვირდით, რომ დატენიანების პროცესი ხელსაყრელია ჰიდროფილური და არა ჰიდროფობიური მასალების ზედაპირზე (დამატებითი სურ. 7a), როგორც მოსალოდნელია ელექტროსტატიკური კოაცერვატებისთვის დაუბალანსებელი მუხტით და, შესაბამისად, მაღალი ელექტროსტატიკური ზედაპირის პოტენციალით.აღსანიშნავია, αS/ΔNt-Tau შერწყმა და ჯომარდობა მნიშვნელოვნად შემცირდა, ხოლო αS/pLK კონდენსატები მნიშვნელოვნად შემცირდა (ნახ. 4).მოკლე ინკუბაციური დროის განმავლობაში, αS/pLK წვეთებმა შეძლეს შეერთება და ჰიდროფილური ზედაპირის დატენიანება, მაგრამ ეს პროცესი სწრაფად შეჩერდა და ინკუბაციიდან 5 საათის შემდეგ, მხოლოდ შეზღუდული შერწყმის მოვლენები და დატენიანება არ შეინიშნებოდა.– გელ-წვეთოვანი გადასვლა.
წარმომადგენლობითი BF (ნაცრისფერი პანელები) და CF (მარჯვენა პანელები, AF488-ის მარკირებული αS მწვანეში) კოაცერვატის ნიმუშები, რომლებიც შეიცავს 100 μM αS (1% ფლუორესცენტური ეტიკეტს) LLPS ბუფერში 100 μM Tau441 (ზედა) ფლუორესცენციის ΔNt-ის თანდასწრებით. -Tau (ცენტრი) ან 1 mM pLK (ქვედა) სხვადასხვა ინკუბაციურ დროსა და ფოკუსურ სიმაღლეზე (z, დაშორება ფირფიტის ძირიდან).ექსპერიმენტები განმეორდა 4-6-ჯერ ერთმანეთისგან დამოუკიდებლად, იგივე შედეგებით.αS/Tau441 coacervates სველდება 24 საათის შემდეგ, რაც ქმნის სურათზე უფრო დიდ ჯოხებს.მასშტაბის ზოლი ყველა სურათისთვის არის 20 μm.
შემდეგ ჩვენ ვიკითხეთ, გამოიწვევდა თუ არა αS/Tau441 LLPS-ში წარმოქმნილი დიდი სითხის მსგავსი ცილის აუზები რომელიმე შესწავლილი ცილის ამილოიდურ აგრეგაციას.ჩვენ მივყვეთ αS/Tau441 წვეთების მომწიფებას დროთა განმავლობაში WF მიკროსკოპით იმავე პირობებში, როგორც ზემოთ, მაგრამ 1 μM AF488-იანი αS და Atto647N-ის მარკირებული Tau441 გამოყენებით (ნახ. 5a).როგორც მოსალოდნელი იყო, ჩვენ ვაკვირდებოდით ცილის სრულ ლოკალიზაციას მომწიფების პროცესში.საინტერესოა, რომ დაახ.5 საათის შემდეგ რაფტების შიგნით დაფიქსირდა უფრო ინტენსიური არაწრიული სტრუქტურები, რომლებსაც ჩვენ ვუწოდეთ „წერტილები“, რომელთაგან ზოგიერთი კოლოკალიზებული იყო αS-ით, ნაწილი კი გამდიდრდა Tau441-ით (ნახ. 5a, თეთრი ისრები).ეს ლაქები ყოველთვის შეინიშნებოდა რაფებში უფრო მეტად αS/ΔNt-Tau-სთვის, ვიდრე αS/ΔNt-Tau-სთვის.არ იყო მკაფიო ლაქები pLK და Tau სისტემების წვეთებში, რომლებიც არაკომპეტენტური იყო შერწყმა/დასველებისთვის.იმის შესამოწმებლად, არის თუ არა ეს ლაქები, რომლებიც შეიცავს αS და Tau441-ს, არის თუ არა ამილოიდის მსგავსი აგრეგატები, ჩვენ ჩავატარეთ მსგავსი ექსპერიმენტი CF მიკროსკოპის გამოყენებით, რომელშიც Tau441 იყო ეტიკეტირებული Atto647N-ით და თავიდანვე დაემატა 12.5 μM ამილოიდისთვის სპეციფიკური თიოფლავინი-T (ThT).საღებავი.მიუხედავად იმისა, რომ αS/Tau441 წვეთების ან ჯოხების ThT შეღებვა არ დაფიქსირებულა ინკუბაციიდან 24 საათის შემდეგაც კი (ნახ. 5b, ზედა რიგი - დარჩენილი წვეთები ცილოვან რაფტებზე), ThT-დადებითი სტრუქტურები, რომლებიც შეიცავს Atto647N-Tau441 რაფტებში, ძალიან სუსტი იყო.ეს იმეორებს ადრე აღწერილი ლაქების ზომას, ფორმას და მდებარეობას (ნახ. 5b, შუა და ქვედა რიგები), რაც ვარაუდობს, რომ ლაქები შეიძლება შეესაბამებოდეს ამილოიდის მსგავს აგრეგატებს, რომლებიც წარმოიქმნება დაბერების სითხის კოაცერვატებში.
WF 25 μM αS სხვადასხვა ინკუბაციურ დროსა და ფოკუსურ სიმაღლეებზე (z, მანძილი შეუზღუდავი ფსკერიდან) 25 μM Tau441 (1 μM AF488 ეტიკეტირებული αS და Atto647N ეტიკეტირებული Tau441) თანდასწრებით მიკროსკოპის ფირფიტის ჭაში LLPS ბუფერით) .ექვსი ექსპერიმენტი დამოუკიდებლად განმეორდა მსგავსი შედეგებით.b CF მიკროსკოპული სურათი 25 μM αS 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-ზე მარკირებული Tau441) და 12.5 μM თიოფლავინი-T (ThT) თანდასწრებით.შეწონილი ცილის წვეთები და დეპონირებული ცილოვანი ჯოხები და ლაქები ნაჩვენებია, შესაბამისად, ზედა და შუა რიგებში.ქვედა სტრიქონი გვიჩვენებს ჯოხების და წვეთების სურათებს 3 დამოუკიდებელი რეპლიკიდან.თეთრი ისრები მიუთითებს ThT-დადებით წერტილებზე ორივე პანელზე.მასშტაბის ზოლი ყველა სურათისთვის არის 20 μm.
თხევადიდან მყარზე გადასვლისას კოაცერვატის პროტეინის ქსელში ცვლილებების უფრო დეტალურად შესასწავლად, ჩვენ გამოვიყენეთ ფლუორესცენციური გამოსახულება (FLIM) და ფორსტერის რეზონანსული ენერგიის გადაცემის მიკროსკოპია (FRET) (სურათი 6 და დამატებითი ნახატები 8 და 9).ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ ფენის შერეული მომწიფება უფრო შედედებულ ან თუნდაც მყარი მსგავსი აგრეგირებული ცილის სტრუქტურაში იწვევს უფრო მჭიდრო კონტაქტს ცილასა და მასზე მიმაგრებულ ფლუორესცენტულ ზონდს შორის, პოტენციურად წარმოქმნის ჩაქრობის ეფექტს, რომელიც გამოიხატება ზონდის ხანმოკლე სიცოცხლეში (τ) , როგორც ზემოთ იყო აღწერილი40.,41 ,42.გარდა ამისა, ორმაგი ეტიკეტირებული ნიმუშებისთვის (AF488 და Atto647N, როგორც FRET დონორი და მიმღები საღებავები, შესაბამისად), τ-ის ამ შემცირებას ასევე შეიძლება ახლდეს კოაცერვატული კონდენსაცია და FRET(E) ეფექტურობის ზრდა LSPT-ის დროს.ჩვენ ვაკვირდებოდით ჯოხებისა და ლაქების წარმოქმნას დროთა განმავლობაში LLPS αS/Tau441 და αS/ΔNt-Tau ნიმუშებში (თითოეული ცილა 25 μM LLPS ბუფერში, რომელიც შეიცავს 1 μM AF488 ეტიკეტირებულ αS და/ან Atto647N ეტიკეტირებულ Tau441 ან ΔNt-Tau).ჩვენ დავაკვირდით ზოგად ტენდენციას, რომ AF488 (τ488) და Atto647N (τ647N) ზონდების ფლუორესცენციის ხანგრძლივობა ოდნავ შემცირდა კოაცერვატების მომწიფებისას (ნახ. 6 და დამატებითი ნახ. 8c).საინტერესოა, რომ ეს ცვლილება მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა რაფტებში არსებული წერტილებისთვის (ნახ. 6c), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ცილების შემდგომი კონდენსაცია მოხდა წერტილებში.ამის მხარდასაჭერად, ფლუორესცენციის სიცოცხლის ხანგრძლივობის მნიშვნელოვანი ცვლილება არ დაფიქსირებულა αS/ΔNt-Tau წვეთებისთვის, რომლებიც დაძველებულია 24 საათის განმავლობაში (დამატებითი ნახ. 8d), რაც ვარაუდობს, რომ წვეთების გელაცია არის ლაქებისგან განსხვავებული პროცესი და რომელსაც არ ახლავს მნიშვნელოვანი მოლეკულური რეორგანიზაცია. კოაცერვატების ფარგლებში.უნდა აღინიშნოს, რომ წერტილებს აქვთ სხვადასხვა ზომის და ცვლადი შინაარსი αS-ში, განსაკუთრებით αS/Tau441 სისტემისთვის (დამატებითი სურ. 8e).წერტილოვანი ფლუორესცენციის სიცოცხლის ხანგრძლივობის შემცირებას თან ახლდა ინტენსივობის მატება, განსაკუთრებით Atto647N მარკირებული Tau441 (დამატებითი სურ. 8a) და უმაღლესი FRET ეფექტურობა αS/Tau441 და αS/ΔNt-Tau სისტემებისთვის, რაც მიუთითებს შემდგომ კონდენსაციაზე LLPS ხუთ საათში. გააქტიურების შემდეგ, სტატიკური ელექტროენერგიის შიგნით არსებული ცილები კონდენსირებული იყო.αS/ΔNt-Tau-თან შედარებით, ჩვენ დავაფიქსირეთ ქვედა τ647N და ოდნავ უფრო მაღალი τ488 მნიშვნელობები αS/Tau441 ლაქებში, რასაც თან ახლავს უფრო დაბალი და არაერთგვაროვანი FRET მნიშვნელობები.შესაძლოა, ეს შეიძლება დაკავშირებული იყოს იმ ფაქტთან, რომ αS/Tau441 სისტემაში, დაკვირვებული და მოსალოდნელი αS სიმრავლე აგრეგატებში უფრო ჰეტეროგენული, ხშირად სუბსტოიქიომეტრიულია Tau-სთან შედარებით, ვინაიდან თავად Tau441 ასევე შეიძლება გაიაროს LLPS და აგრეგაცია (დამატებითი ნახ. 8e). .თუმცა, წვეთების შერწყმის ხარისხი, რაფტის ფორმირება და, რაც მთავარია, ცილების აგრეგაცია თხევადი მსგავსი კოაცერვატების ფარგლებში მაქსიმალურია, როდესაც არსებობს Tau441 და αS.
αS/Tau441 და αS/ΔNt-Tau უწყვეტი ფლუორესცენციული მიკროსკოპის (FLIM) გამოსახულებები თითოეული პროტეინის 25 μM-ზე (1 μM AF488-ის მარკირებული αS და 1 μM Atto647N-ის მარკირებული Tau441 ან ΔNt-Tau) LLPS ბუფერში.სვეტები აჩვენებს LLPS ნიმუშების წარმომადგენლობით სურათებს მომწიფების სხვადასხვა დროს (30 წთ, 5 სთ და 24 სთ).წითელი ჩარჩო გვიჩვენებს რეგიონს, რომელიც შეიცავს αS/Tau441 ლაქებს.სიცოცხლის ხანგრძლივობა ნაჩვენებია ფერადი ზოლების სახით.მასშტაბის ზოლი = 20 μm ყველა სურათისთვის.b არჩეული არეალის გადიდებული FLIM სურათი, რომელიც ნაჩვენებია პანელზე a წითელ ველში.სიცოცხლის დიაპაზონი ნაჩვენებია იმავე ფერის მასშტაბის გამოყენებით, როგორც a პანელში.მასშტაბის ზოლი = 5 μm.c ჰისტოგრამები, რომლებიც აჩვენებენ AF488 (მიმაგრებულია αS-ზე) ან Atto647N (მიმაგრებული Tau-ზე) სხვადასხვა ცილის სახეობებისთვის (წვეთები-D-, ჯოხი-R- და ლაქა-P), იდენტიფიცირებული FLIM სურათებში, ჩაწერილი αS--სთვის) დროის განაწილების სიცოცხლის ხანგრძლივობა Tau441 და αS/ΔNt-Tau კოაცერვატის ნიმუშები (N = 17-32 ROI D-სთვის, 29-44 ROI R-სთვის და 21-51 ROI ქულებისთვის).საშუალო და მედიანური მნიშვნელობები ნაჩვენებია ყუთების შიგნით, შესაბამისად, ყვითელი კვადრატების და შავი ხაზების სახით.ყუთის ქვედა და ზედა საზღვრები, შესაბამისად, წარმოადგენს პირველ და მესამე მეოთხედს, ხოლო მინიმალური და მაქსიმალური მნიშვნელობები 1,5-ჯერადი ინტერკტილური დიაპაზონის ფარგლებში (IQR) ნაჩვენებია ულვაშების სახით.გარედან გამოსახულია შავი ბრილიანტი.სტატისტიკური მნიშვნელოვნება განაწილებათა წყვილებს შორის განისაზღვრა ორი ნიმუშიანი t-ტესტის გამოყენებით, არათანაბარი ვარიაციების გათვალისწინებით.ორკუდიანი t-ტესტი p-მნიშვნელობები ნაჩვენებია ვარსკვლავით თითოეული შედარებული მონაცემების წყვილისთვის (* p-მნიშვნელობა > 0.01, ** p-მნიშვნელობა > 0.001, *** p-მნიშვნელობა > 0.0001, **** p-მნიშვნელობა > 0.00001), ns მიუთითებს უგულებელყოფაზე (p-მნიშვნელობა > 0.05).ზუსტი p მნიშვნელობები მოცემულია დამატებით ცხრილში 1, ხოლო ორიგინალური მონაცემები წარმოდგენილია როგორც ნედლეული მონაცემთა ფაილები.
ლაქების/აგრეგატების ამილოიდის მსგავსი ბუნების შემდგომი დემონსტრირებისთვის, ჩვენ ვამუშავებდით შეუღებავ კოაცერვატის ნიმუშებს 24 საათის განმავლობაში (1 M) NaCl-ის მაღალი კონცენტრაციით, რამაც გამოიწვია აგრეგატების გამოყოფა ცილოვანი კოაცერვატებისაგან.როდესაც იზოლირებული აგრეგატები (ანუ აგრეგატების დისპერსიული ხსნარი) დაფიქსირდა ატომური ძალის მიკროსკოპის (AFM) გამოყენებით, ჩვენ დავაკვირდით უპირატესად სფერულ მორფოლოგიას რეგულარული სიმაღლით დაახლოებით 15 ნმ, რომელიც დაკავშირებულია მარილის მაღალი კონცენტრაციის პირობებში, მსგავსი ტიპიური ამილოიდური ფიბრილების ქცევა ზედაპირზე ძლიერი ჰიდროფობიური ეფექტის გამო (გაითვალისწინეთ, რომ ფიბრილებს, როგორც წესი, აქვთ ~10 ნმ სიმაღლე) (დამატებითი სურ. 10a).საინტერესოა, რომ როდესაც იზოლირებული აგრეგატები ინკუბირებული იყო ThT-ით სტანდარტულ ThT ფლუორესცენციულ ანალიზში, ჩვენ დავაფიქსირეთ ThT ფლუორესცენციის კვანტური გამოსავლიანობის მკვეთრი ზრდა, შედარება, რაც დაფიქსირდა, როდესაც საღებავი ინკუბირებული იყო ტიპიური αS ამილოიდური ფიბრილებით (დამატებითი სურ. 10b). კოაცერვატის აგრეგატები შეიცავს ამილოიდის მსგავს სტრუქტურებს..სინამდვილეში, აგრეგატები იყო ტოლერანტული მარილის მაღალი კონცენტრაციის მიმართ, მაგრამ მგრძნობიარე იყო 4 M გუანიდინ ქლორიდის (GdnHCl) მიმართ, როგორც ტიპიური ამილოიდური ფიბრილები (დამატებითი სურ. 10c).
შემდეგ, ჩვენ გავაანალიზეთ აგრეგატების შემადგენლობა ერთი მოლეკულის ფლუორესცენციის, სპეციფიკური ფლუორესცენციის კორელაციის/ჯვარედინი კორელაციის სპექტროსკოპიის (FCS/FCCS) და ორი ფერის დამთხვევის გამოვლენის (TCCD) გამოყენებით.ამ მიზნით, ჩვენ გამოვყავით ინკუბაციიდან 24 საათის შემდეგ წარმოქმნილი აგრეგატები 100 μl LLPS ნიმუშებში, რომლებიც შეიცავდნენ αS და Tau441 (ორივე 25 μM) ერთად 1 μM AF488-ით ეტიკეტირებული αS და 1 μM Atto647N ეტიკეტირებული Tau441.მიღებული დისპერსიული აგრეგატის ხსნარი განზავდეს მონომოლეკულურ მდგომარეობაში იმავე PEG-ის გარეშე ბუფერისა და 1 M NaCl-ის გამოყენებით (იგივე ბუფერი, რომელიც გამოიყენება აგრეგატების კოაცერვატისგან განცალკევებისთვის), რათა თავიდან აიცილოთ რაიმე შესაძლო ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედება LLPS-სა და პროტეინს შორის.ერთი მოლეკულის დროის ტრაექტორიის მაგალითი ჩანს ნახაზზე 7a.FCCS/FCS ანალიზმა (ჯვარედინი კორელაცია, CC და ავტოკორელაცია, AC) აჩვენა, რომ ნიმუშებში უხვად იყო αS და ტაუს შემცველი აგრეგატები (იხ. CC მრუდი ნახ. 7b, მარცხენა პანელი) და ნარჩენი მონომერული ცილის ჭარბი წარმოშობა. განზავების პროცესის შედეგი (იხ. AC მრუდები სურათზე 7b, მარცხენა პანელი).საკონტროლო ექსპერიმენტებმა, რომლებიც ჩატარდა ხსნარის იმავე პირობებში, მხოლოდ მონომერული ცილების შემცველი ნიმუშების გამოყენებით, არ აჩვენა CC მრუდი, და AC მრუდები კარგად ერგება ერთკომპონენტიან დიფუზიის მოდელს (Eq. 4), სადაც მონომერულ ცილებს აქვთ დიფუზიის მოსალოდნელი კოეფიციენტები (ნახ. 7b. ), მარჯვენა პანელი).აგრეგირებული ნაწილაკების დიფუზიის კოეფიციენტი 1 μm2/s-ზე ნაკლებია, მონომერული ცილების კი დაახლოებით 1 μm2/s.50-100 მკმ/წმ;მნიშვნელობები მსგავსია ადრე გამოქვეყნებული მნიშვნელობებისა სონიკირებული αS ამილოიდური ფიბრილებისა და მონომერული αS-სთვის ცალკე ხსნარის ანალოგიურ პირობებში44.როდესაც ჩვენ გავაანალიზეთ აგრეგატები TCCD აფეთქების ანალიზით (ნახ. 7c, ზედა პანელი), აღმოვაჩინეთ, რომ თითოეულ იზოლირებულ აგრეგატში (αS/Tau ჰეტეროაგრეგატი), აღმოჩენილი აგრეგატების დაახლოებით 60% შეიცავდა როგორც αS-ს, ასევე tau-ს, დაახლოებით 30% შეიცავდა მხოლოდ ტაუ, დაახლოებით 10% αS მხოლოდ.αS/Tau ჰეტეროაგრეგატების სტოქიომეტრიულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ ჰეტეროაგრეგატების უმეტესობა გამდიდრებული იყო ტაუში (სტოიქიომეტრია 0,5-ზე ქვემოთ, ტაუს მოლეკულების საშუალო რაოდენობა აგრეგატზე 4-ჯერ მეტია αS მოლეკულებზე), რაც შეესაბამება ჩვენს მუშაობას, რომელიც დაფიქსირდა FLIM in situ-ში. ექსპერიმენტები..FRET ანალიზმა აჩვენა, რომ ეს აგრეგატები შეიცავდა ორივე პროტეინს, თუმცა FRET-ის ფაქტობრივ მნიშვნელობებს ამ შემთხვევაში დიდი მნიშვნელობა არ აქვს, რადგან ფტორფორების განაწილება თითოეულ აგრეგატში შემთხვევითი იყო ექსპერიმენტში გამოყენებული არალეგირებული ცილის სიჭარბის გამო.საინტერესოა, რომ როდესაც ჩვენ ჩავატარეთ იგივე ანალიზი 45,46 მომწიფებული ამილოიდის აგრეგაციის დეფიციტის ტაუ ვარიანტის გამოყენებით (იხ. დამატებითი სურათი 11a,b), ჩვენ შევამჩნიეთ, რომ მიუხედავად იმისა, რომ αS ელექტროსტატიკური აგრეგაცია იგივე იყო (დამატებითი სურ. 11c, d), კოაცერვატის შიგნით აგრეგატების წარმოქმნის უნარი მკვეთრად შემცირდა და FLIM-მა აღმოაჩინა რამდენიმე ლაქა in situ ექსპერიმენტებში და სუსტი ჯვარედინი კორელაციური მრუდები დაფიქსირდა იზოლირებული აგრეგატის ნიმუშებისთვის.თუმცა, აღმოჩენილი აგრეგატების მცირე რაოდენობისთვის (Tau441-ის მხოლოდ ერთი მეათედი), ჩვენ დავაკვირდით, რომ თითოეული აგრეგატი გამდიდრებული იყო αS-ით, ვიდრე ეს Tau ვარიანტი, აღმოჩენილი აგრეგატების დაახლოებით 50% შეიცავდა მხოლოდ αS მოლეკულებს და αS იყო ჰეტეროგენული ჭარბი რაოდენობით. .აგრეგატები (იხ. დამატებითი სურათი 11e), განსხვავებით Tau441-ის მიერ წარმოქმნილი ჰეტეროგენული აგრეგატებისგან (ნახ. 6f).ამ ექსპერიმენტების შედეგებმა აჩვენა, რომ მიუხედავად იმისა, რომ αS-ს შეუძლია დაგროვდეს ტაუსთან კოაცერვატში, ტაუს ნუკლეაცია უფრო ხელსაყრელია ამ პირობებში და შედეგად მიღებული ამილოიდის მსგავსი აგრეგატები შეუძლიათ იმოქმედონ, როგორც αS და ტაუს ფორმა.თუმცა, როგორც კი ტაუს მდიდარი ბირთვი ჩამოყალიბდება, ჰეტეროტიპული ურთიერთქმედებები αS-სა და tau-ს შორის უპირატესობას ანიჭებს აგრეგატებში ტაუს მოლეკულებს შორის ჰომოტიპურ ურთიერთქმედებას;ჩვენ ასევე ვაკვირდებით ცილოვან ქსელებს თხევად αS/tau კოაცერვატებში.
a იზოლირებული აგრეგატების ცალკეული მოლეკულების წარმომადგენლობითი ფლუორესცენციის დროებითი კვალი, რომლებიც წარმოიქმნება αS/Tau441 ელექტროსტატიკური კოაცერვატებში.აფეთქებები, რომლებიც შეესაბამება αS/Tau441 კოაგრეგატებს (აფეთქებები მითითებულ ზღურბლზე ზემოთ) დაფიქსირდა გამოვლენის სამ არხში (AF488 და Atto647N ემისია პირდაპირი აგზნების შემდეგ, ლურჯი და წითელი ხაზები, Atto647N ემისია არაპირდაპირი აგზნების შემდეგ), FRET, იისფერი ხაზი).b LLPS-დან (მარცხენა პანელი) მიღებული αS/Tau441 იზოლირებული აგრეგატების ნიმუშის FCS/FCCS ანალიზი.AF488-ისა და Atto647N-ის ავტოკორელაციის (AC) მრუდები ნაჩვენებია შესაბამისად ლურჯ და წითლად, ხოლო ჯვარედინი კორელაციის (CC) მრუდები, რომლებიც დაკავშირებულია ორივე საღებავის შემცველ აგრეგატებთან, ნაჩვენებია იისფერი.AC მრუდები ასახავს მარკირებული მონომერული და აგრეგირებული ცილის სახეობების არსებობას, ხოლო CC მრუდები აჩვენებს მხოლოდ ორმაგად მარკირებული აგრეგატების დიფუზიას.იგივე ანალიზი, მაგრამ იმავე ხსნარის პირობებში, როგორც იზოლირებულ ლაქებში, ნიმუშები, რომლებიც შეიცავს მხოლოდ მონომერულ αS-ს და Tau441-ს, ნაჩვენებია როგორც კონტროლი მარჯვენა პანელში.c αS/Tau441 ელექტროსტატიკური კოაცერვატებში წარმოქმნილი იზოლირებული აგრეგატების ცალკეული მოლეკულების ფლუორესცენციული ფლეშ ანალიზი.ინფორმაცია თითოეული აგრეგატის შესახებ, რომელიც ნაპოვნია ოთხ განსხვავებულ გამეორებაში (N = 152) დახატულია მათი სტექიომეტრიის, S მნიშვნელობებისა და FRET ეფექტურობის მიხედვით (ზედა პანელი, ფერის ზოლი ასახავს მოვლენას).აგრეგატების სამი ტიპი შეიძლება გამოიყოს: -αS-მხოლოდ აგრეგატები S~1 და FRET~0-ით, მხოლოდ Tau-ს აგრეგატები S~0 და FRET~1-ით და ჰეტეროგენული Tau/αS აგრეგატები შუალედური S და FRET თანხის შეფასება. თითოეულ ჰეტეროგენულ აგრეგატში გამოვლენილი ორივე მარკერის პროტეინი (N = 100) ნაჩვენებია ქვედა პანელზე (ფერთა შკალა ასახავს მოვლენას).ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
თხევადი ცილის კონდენსატების მომწიფება ან დაბერება გელისმაგვარ ან მყარ სტრუქტურებად დროთა განმავლობაში მოხსენებული იყო, რომ ჩართული იყო კონდენსატის47 ფიზიოლოგიურ რამდენიმე ფუნქციაში, ასევე დაავადებაში, როგორც პათოლოგიური პროცესი, რომელიც წინ უძღვის ამილოიდის აგრეგაციას 7, 48, 49. აქ ჩვენ დეტალურად ვსწავლობთ ფაზის გამოყოფას და ქცევას.LSPT αS შემთხვევითი პოლიკათიონების არსებობისას კონტროლირებად გარემოში დაბალ მიკრომოლარულ კონცენტრაციებში და ფიზიოლოგიურად რელევანტურ პირობებში (გაითვალისწინეთ, რომ αS-ის გამოთვლილი ფიზიოლოგიური კონცენტრაცია არის >1 μM50), LPS-ის ტიპიური თერმოდინამიკური ქცევის შემდეგ.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ αS, რომელიც შეიცავს უაღრესად უარყოფითად დამუხტულ C-ტერმინალურ ზონას ფიზიოლოგიურ pH-ზე, შეუძლია შექმნას ცილებით მდიდარი წვეთები წყალხსნარში LLPS-ის მეშვეობით მაღალი კათიონური არეული პეპტიდების არსებობისას, როგორიცაა pLK ან Tau ელექტროსტატიკური პროცესის მეშვეობით. კომპლექსური კონდენსაცია აგრეგაციის მაკრომოლეკულების არსებობისას.ამ პროცესს შეიძლება ჰქონდეს შესაბამისი ეფექტი უჯრედულ გარემოში, სადაც αS ხვდება სხვადასხვა პოლიკატიონურ მოლეკულებს, რომლებიც დაკავშირებულია მის დაავადებასთან ასოცირებულ აგრეგაციასთან, როგორც in vitro, ასევე in vivo51,52,53,54.
ბევრ კვლევაში ცილის დინამიკა წვეთებში განიხილება, როგორც მომწიფების პროცესის განმსაზღვრელი ერთ-ერთი ძირითადი ფაქტორი55,56.პოლიკატიონებთან ელექტროსტატიკური αS კოასერვატებში, მომწიფების პროცესი აშკარად დამოკიდებულია პოლიკატიონებთან ურთიერთქმედების სიძლიერეზე, ვალენტობასა და ამ ურთიერთქმედების სიმრავლეზე.წონასწორობის თეორია ვარაუდობს, რომ ორი თხევადი მდგომარეობის წონასწორული ლანდშაფტი იქნება ბიოპოლიმერებით მდიდარი დიდი წვეთების არსებობა, რომლებიც ამოძრავებენ LLPS57,58.წვეთების ზრდა შეიძლება მიღწეული იყოს ოსტვალდის მომწიფებით59, შეერთებით60 ან თავისუფალი მონომერის მოხმარებით დისპერსიულ ფაზაში61.αS და Tau441, ΔNt-Tau ან pLK-სთვის, ცილის უმეტესი ნაწილი კონცენტრირებული იყო კონდენსატში ამ კვლევაში გამოყენებულ პირობებში.თუმცა, მიუხედავად იმისა, რომ სრული ზომის ტაუს წვეთები სწრაფად ერწყმოდა ზედაპირის დატენიანებას, წვეთების შერწყმა და დასველება რთული იყო ΔNt-Tau-სთვის და pLK-სთვის, რაც მიუთითებს თხევადი თვისებების სწრაფ დაკარგვაზე ამ ორ სისტემაში.ჩვენი FLIM-FRET ანალიზის მიხედვით, დაძველებულმა pLK და ΔNt-Tau წვეთებმა აჩვენეს ცილის აგრეგაციის მსგავსი ხარისხი (მსგავსი ფლუორესცენციის სიცოცხლის ხანგრძლივობა), როგორც თავდაპირველი წვეთები, რაც ვარაუდობს, რომ ორიგინალური ცილის ქსელი შენარჩუნებული იყო, თუმცა უფრო ხისტი.
ჩვენ რაციონალიზაციას ვახდენთ ჩვენი ექსპერიმენტული შედეგების შემდეგ მოდელში (სურათი 8).თავდაპირველად დროებით წარმოქმნილი წვეთები ხშირად წარმოადგენენ ცილოვან ქსელებს ელექტროსტატიკური კომპენსაციის გარეშე და, შესაბამისად, არსებობს მუხტის დისბალანსის ადგილები, განსაკუთრებით წვეთების ინტერფეისზე, რაც იწვევს წვეთებს მაღალი ელექტროსტატიკური ზედაპირის პოტენციალის მქონე.მუხტის კომპენსაციისთვის (ფენომენს, რომელსაც ჩვეულებრივ უწოდებენ ვალენტურ დაქვეითებას) და წვეთების ზედაპირული პოტენციალის შესამცირებლად, წვეთები შეიძლება შეიცავდეს ახალ პოლიპეპტიდებს განზავებული ფაზიდან, ცილოვანი ქსელების რეორგანიზაცია მუხტ-მუხტის ურთიერთქმედების ოპტიმიზაციისთვის და სხვა წვეთებთან ურთიერთქმედების მიზნით.ზედაპირებით (დასველება).αS/pLK წვეთები, მათი უფრო მარტივი ცილოვანი ქსელის გამო (მხოლოდ ჰეტეროტიპული ურთიერთქმედება αS-სა და pLK-ს შორის) და ცილა-ცილის ურთიერთქმედებისადმი უფრო დიდი აფინურობის გამო, როგორც ჩანს, უფრო სწრაფად ახერხებს კონდენსატის მუხტის დაბალანსებას;მართლაც, ჩვენ დავინახეთ უფრო სწრაფი ცილის კინეტიკა თავდაპირველად წარმოქმნილ αS/pLK კოაცერვატებში, ვიდრე αS/Tau-ში.ვალენტობის ამოწურვის შემდეგ, ურთიერთქმედება ხდება ნაკლებად ეფემერული და წვეთები კარგავენ თხევად თვისებებს და გადაიქცევიან გელის მსგავს, აალებადი წვეთებად, დაბალი ელექტროსტატიკური ზედაპირის პოტენციალით (და შესაბამისად, ვერ ატენიანებენ ზედაპირს).ამის საპირისპიროდ, αS/Tau წვეთები ნაკლებად ეფექტურია წვეთოვანი მუხტის ბალანსის ოპტიმიზაციაში უფრო რთული ცილის ქსელების (როგორც ჰომოტიპური, ასევე ჰეტეროტიპული ურთიერთქმედებით) და ცილოვანი ურთიერთქმედების სუსტი ბუნების გამო.ეს იწვევს წვეთებს, რომლებიც ინარჩუნებენ სითხის ქცევას დიდი ხნის განმავლობაში და ავლენენ მაღალი ელექტროსტატიკური ზედაპირის პოტენციალს, რომელიც მიდრეკილია მინიმუმამდე შემცირების გზით შერწყმით და გაზრდით (რითაც მცირდება წვეთების ზედაპირის ფართობი/მოცულობის თანაფარდობა) და ჰიდროფილური ზედაპირის ქიმიის დატენიანებით.ეს ქმნის დიდ კონცენტრირებულ ცილის ბიბლიოთეკებს, რომლებიც ინარჩუნებენ სითხის თვისებებს, რადგან ურთიერთქმედება ძალიან გარდამავალია ცილოვან ქსელში მუხტის ოპტიმიზაციის მუდმივი ძიების გამო.საინტერესოა, რომ Tau-ს N-ტერმინალურად შეკვეცილი ფორმები, მათ შორის ზოგიერთი ბუნებრივად წარმოქმნილი იზოფორმა62, ავლენს შუალედურ ქცევას, ზოგიერთი კოაცერვატი ბერდება αS-ით გრძელვადიანი გელის მსგავს წვეთებად, ზოგი კი გარდაიქმნება დიდ თხევად კონდენსატებად.αS ელექტროსტატიკური კოაცერვატების მომწიფების ეს ორმაგობა შეესაბამება ბოლოდროინდელ LLPS თეორიულ და ექსპერიმენტულ კვლევებს, რომლებმაც დაადგინეს კორელაცია ვალენტურობის დაქვეითებასა და კონდენსატებში ელექტროსტატიკურ საცერს შორის, როგორც კონდენსატის ზომისა და სითხის თვისებების კონტროლის გასაღები.მექანიზმი 58.61.
ეს სქემა გვიჩვენებს ამილოიდის აგრეგაციის სავარაუდო გზა αS და Tau441-ისთვის LLPS და LSPT მეშვეობით.დამატებითი ანიონებით მდიდარი (წითელი) და კათიონებით მდიდარი (ლურჯი) რეგიონებით, დამაკმაყოფილებელი ვალენტობის მქონე αS და ტაუ ელექტროსტატიკური კოაცერვატები აქვთ ქვედა ზედაპირის ენერგია და, შესაბამისად, ნაკლები შერწყმა, რაც იწვევს წვეთების სწრაფ დაბერებას.მიიღწევა სტაბილური არააგლომერირებული გელის მდგომარეობა..ეს ვითარება ძალიან ხელსაყრელია αS/pLK სისტემის შემთხვევაში მისი უფრო მაღალი აფინურობისა და ცილა-წყვილის ურთიერთქმედების უფრო მარტივი ქსელის გამო, რაც იძლევა გელის მსგავსი სწრაფი გადასვლის საშუალებას.პირიქით, არადამაკმაყოფილებელი ვალენტობის მქონე წვეთები და, შესაბამისად, ცილებით დამუხტული რეგიონები, რომლებიც ხელმისაწვდომია ურთიერთქმედებისთვის, აადვილებს კოაცერვატის შერწყმას და ატენიანებს ჰიდროფილურ ზედაპირს, რათა შეამციროს მისი მაღალი ზედაპირის ენერგია.ეს სიტუაცია სასურველია αS/Tau441 კოაცერვატებისთვის, რომლებსაც აქვთ მრავალვალენტიანი კომპლექსური ქსელი, რომელიც შედგება სუსტი Tau-Tau და αS-Tau ურთიერთქმედებებისგან.თავის მხრივ, უფრო დიდი კოაცერვატები უფრო ადვილად შეინარჩუნებენ სითხის მსგავს თვისებებს, რაც საშუალებას მისცემს სხვა ცილა-ცილა ურთიერთქმედებას.საბოლოოდ, ამილოიდური ჰეტეროგენული აგრეგატები, რომლებიც შეიცავს როგორც αS-ს, ასევე tau-ს, წარმოიქმნება კოაცერვატულ სითხეში, რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს ინკლუზიურ სხეულებში აღმოჩენილებთან, რომლებიც ნეიროდეგენერაციული დაავადებების დამახასიათებელი ნიშნებია.
სითხის მსგავსი დიდი სტრუქტურები, რომლებიც წარმოიქმნება αS/Tau441-ის მომწიფების დროს უაღრესად გადატვირთული, მაგრამ დინამიური ცილოვანი გარემოთი და, უფრო მცირე ზომით, αS/ΔNt-Tau კოაცერვატები იდეალური რეზერვუარებია ცილების აგრეგაციისთვის.ჩვენ ნამდვილად დავაკვირდით ამ ტიპის ცილის კოაცერვატებში მყარი ცილის აგრეგატების წარმოქმნას, რომლებიც ხშირად შეიცავს αS-ს და ტაუს.ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ეს ჰეტეროაგრეგატები სტაბილიზირებულია არაელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებით, შეუძლიათ ამილოიდის სპეციფიკური ThT საღებავების შეკვრა ისევე, როგორც ტიპიური ამილოიდური ფიბრილები და მართლაც აქვთ მსგავსი წინააღმდეგობა სხვადასხვა გავლენის მიმართ.LLPS-ის მიერ წარმოქმნილ αS/tau აგრეგატებს აჩვენეს ამილოიდის მსგავსი თვისებები.მართლაც, ამილოიდური აგრეგაციის დეფიციტის Tau-ს მომწიფებული ვარიანტი მნიშვნელოვნად ზიანდება ამ ჰეტეროგენული αS აგრეგატების ფორმირებაში თხევადი ელექტროსტატიკური კოაცერვატის ფარგლებში.αS/Tau441 აგრეგატების წარმოქმნა დაფიქსირდა მხოლოდ კოაცერვატების შიგნით, რომლებმაც შეინარჩუნეს სითხის მსგავსი თვისებები და არასდროს, თუ კოაცერვატები/წვეთები არ მიაღწიეს გელის მდგომარეობას.ამ უკანასკნელ შემთხვევაში, ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების გაზრდილი სიძლიერე და, შედეგად, ცილოვანი ქსელის სიმტკიცე ხელს უშლის ცილების აუცილებელ კონფორმაციულ გადანაწილებას ამილოიდის ნუკლეაციისთვის აუცილებელი ცილოვანი ახალი ურთიერთქმედების დასამყარებლად.თუმცა, ამის მიღწევა შესაძლებელია უფრო მოქნილ, თხევადი მსგავსი კოაცერვატებში, რომლებიც, თავის მხრივ, უფრო თხევად დარჩებიან, რადგან ისინი ზომაში იზრდებიან.
ის ფაქტი, რომ აგრეგატების წარმოქმნა შედედებულ ფაზაში სასურველია მსხვილ αS/Tau კონდენსატებში, ვიდრე მცირე წვეთებში, რომლებიც სწრაფად ჟელავს, ხაზს უსვამს ფაქტორების იდენტიფიცირების მნიშვნელობას, რომლებიც აკონტროლებენ წვეთების შერწყმას.ამრიგად, არა მხოლოდ არსებობს ფაზის გამოყოფის ტენდენცია, არამედ კონდენსატის ზომა უნდა იყოს კონტროლირებადი სათანადო ფუნქციონირებისთვის და ასევე დაავადების პრევენციისთვის58,61.ჩვენი შედეგები ასევე ხაზს უსვამს LLPS-სა და LSPT-ს შორის ბალანსის მნიშვნელობას αS/Tau სისტემისთვის.მიუხედავად იმისა, რომ წვეთების ფორმირებამ შეიძლება დაიცვას ამილოიდის აგრეგაცია გაჯერების პირობებში ხელმისაწვდომი ცილის მონომერების რაოდენობის შემცირებით, როგორც ეს იყო შემოთავაზებული სხვა სისტემებში63,64, წვეთების შერწყმამ წვეთების მაღალ დონეზე შეიძლება გამოიწვიოს ცილების შიდა აგრეგაცია ნელი კონფორმაციული გადაწყობის გზით.ცილის ქსელები..
საერთო ჯამში, ჩვენი მონაცემები ხაზს უსვამს შეკრული ვალენტობის და დაკმაყოფილებული/უკმაყოფილო ურთიერთქმედების შესაბამისობას ვარდნის ქსელებში LSPT-ის კონტექსტში.კერძოდ, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ სრულმეტრაჟიან αS/Tau441 კონდენსატებს შეუძლიათ ეფექტურად შერწყმა და ბირთვი წარმოქმნან ამილოიდის მსგავსი ჰეტეროაგრეგატები, რომლებიც მოიცავს ორივე ცილებს და გვთავაზობენ მოლეკულურ მექანიზმს ჩვენი ექსპერიმენტული შედეგების საფუძველზე.ორი ცილის გაერთიანება αS/Tau სითხის კოაცერვატში, რომელსაც აქ ვახსენებთ, შეიძლება მართლაც დაკავშირებული იყოს ორი ცილის თანალოკალიზაციასთან ჩანართებში, რომლებიც დაავადების დამახასიათებელი ნიშნებია და შეიძლება ხელი შეუწყოს LLPS-სა და LLPS-ს შორის ურთიერთობის გაგებას. ამილოიდის აგრეგაცია, რომელიც გზას უხსნის მაღალ დამუხტულ დევნილს ნეიროდეგენერაციაში.
მონომერული WT-αS, ცისტეინის მუტანტები (Q24C-αS, N122C-αS) და ΔCt-αS ვარიანტები (Δ101-140) გამოხატული იყო E. coli-ში და გაწმენდილი იყო, როგორც ადრე იყო აღწერილი.5 მმ DTT ჩართული იყო αS ცისტეინის მუტანტების გაწმენდის ყველა ეტაპზე დისულფიდური ბმის წარმოქმნის თავიდან ასაცილებლად.Tau441 იზოფორმა (პლაზმიდი მიღებული Addgene #16316-დან), ΔNt-Tau ვარიანტი (Δ1–150, მიღებული IVA კლონირებით პრაიმერებით CTTTAAGAAGGAGAGAGATACATATGATCGCCACACCCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC-27TCau3-5-AggantpurifD5-Aggant. პრაიმერი) E. coli კულტურები იყო გაიზარდა OD600 = 0.6-0.7-მდე 37°C-ზე და 180 rpm-ზე და გამოხატულება იყო გამოწვეული IPTG-ით 3 საათის განმავლობაში 37°C-ზე.ამოიღეთ უჯრედები 11,500 xg 15 წუთის განმავლობაში 4 °C-ზე და დაიბანეთ მარილიანი ბუფერით, რომელიც შეიცავს 150 მმ NaCl.გრანულები ხელახლა შეაჩერეთ ლიზის ბუფერში (20 მლ 1 ლ ლბ-ზე: MES 20 მმ, pH 6.8, NaCl 500 მმ, EDTA 1 მმ, MgCl2 0.2 მმ, DTT 5 მმ, PMSF 1 მმ, ბენზამიდინი 50 μპტინი 10 მმ, cope).ხმოვანი საფეხური შესრულდა ყინულზე 80% ამპლიტუდით 10 იმპულსისთვის (1 წთ ჩართვა, 1 წთ გამორთვა).არ უნდა აღემატებოდეს 60 მლ ერთ ულტრაბგერით.E. coli ლიზატები გაცხელდა 95°C-ზე 20 წუთის განმავლობაში, შემდეგ გაცივდა ყინულზე და ცენტრიფუგირდა 127,000×გრ-ზე 40 წუთის განმავლობაში.გამწმენდი სუპერნატანტი წაისვით 3,5 kDa მემბრანაზე (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) და დიალიზებული იქნა 4 ლ დიალიზის ბუფერზე (20 მმ MES, pH 6.8, NaCl 50 მმ, EDTA 1 მმ, MgCl2 2 მმ, DTT , PMSF 0.1 მმ) 10 საათის განმავლობაში.5 მლ კათიონგაცვლის სვეტი (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, აშშ) დაბალანსებული იყო წონასწორობის ბუფერით (20 მმ MES, pH 6.8, 50 მმ NaCl, 1 მმ EDTA, 2 მმ MgCl2, 2 მმ DTT, 0.1 მმ PMSF).ტაულიზატი გაფილტრული იყო 0,22 μm PVDF ფილტრის მეშვეობით და შეჰყავდათ სვეტში 1 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით.გამორეცხვა განხორციელდა თანდათანობით, ტაუ გამოირეცხებოდა 15-30% გამორეცხვის ბუფერით (20 მმ MES, pH 6.8, 1 მ NaCl, 1 მმ EDTA, 2 მმ MgCl2, 2 მმ DTT, 0.1 მმ PMSF).ფრაქციები გაანალიზდა SDS-PAGE-ით და ნებისმიერი ფრაქცია, რომელიც შეიცავდა ერთ ზოლს ტაუს მოსალოდნელი მოლეკულური მასით, კონცენტრირებული იყო 10 kDa ცენტრიფუგის ფილტრის გამოყენებით და ჩანაცვლდა ბუფერით, რომელიც შეიცავს 10 მმ HEPES, pH 7.4, NaCl 500 მმ და DTT 2 მმ. ცილის საბოლოო კონცენტრაცია იყო 100 მკმ.შემდეგ პროტეინის ხსნარი გაიარეს 0,22 μm PVDF ფილტრში, სწრაფად გაყინული და ინახება -80°C-ზე.პროტეინი K18 მოწოდებული იყო პროფესორმა ალბერტო ბოფიმ.პრეპარატის სისუფთავე იყო >95%, როგორც დადასტურებულია SDS-PAGE-ით და MALDI-TOF/TOF-ით.სხვადასხვა ცისტეინები ქიმიურად იყო მარკირებული AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, აშშ) ან TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, ტორონტო, კანადა).დადასტურებული იყო შთანთქმის და MALDI-TOF/TOF-ით.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau და K18 ეტიკეტირებული იყო მშობლიური ცისტეინის ნარჩენებით 191 და 322 პოზიციებზე Atto647N-მალეიმიდის გამოყენებით (ATTO-TEC GmbH, Siegen, გერმანია) იგივე პროცედურის შემდეგ.წმინდა გადასახადი თითო ნარჩენის რუქებზე αS და Tau441-ისთვის შეიქმნა CIDER66-ის გამოყენებით.
მყარი პოლი-L-ლიზინი (pLK DP 90-110 NMR-ის მიხედვით მიმწოდებლისგან, Alamanda Polymers Inc, ჰანტსვილი, ალაბამა, აშშ) იხსნება 10 მმ HEPES-ში, 100 მმ NaCl, pH 7,4-დან 10 მმ-მდე კონცენტრაცია, პროცესი სნეულირებულია 5 წუთში ულტრაბგერითი წყლის აბაზანაში და შეინახეთ -20°C ტემპერატურაზე.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) და FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) წყალში ხსნადია და ფართოდ არის გავრცელებული LLPS ბუფერში.დიალიზი აშორებს დამაბინძურებელ მარილებს.შემდეგ ისინი გაფილტრული იქნა შპრიცის ფილტრის მეშვეობით ფორების ზომით 0,22 მკმ და მათი კონცენტრაცია გამოითვალა რეფრაქტომეტრის გამოყენებით (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS ნიმუშები მომზადდა ოთახის ტემპერატურაზე შემდეგი თანმიმდევრობით: ბუფერი და ექსტრუზია იყო შერეული და 1 მმ ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინი (TCEP, Carbosynth, Compton, დიდი ბრიტანეთი), 1 მმ 2,2,2,2-(ეთანი- 1, 2-დიილდინიტრილი) ტეტრაძმარმჟავა (EDTA, კარბოქსინთი) და 1% პროტეაზას ინჰიბიტორის ნარევი (PMSF 100 მმ, ბენზიმიდი 1 მმ, ლეუპეპტინი 5 მკმ).შემდეგ ემატება αS და შერწყმული პოლიკათიონები (პარამეტრები pLK ან Tau).თიოფლავინ-T დროის სერიის ექსპერიმენტებისთვის (ThT, Carbosynth, Compton, დიდი ბრიტანეთი), გამოიყენეთ ThT მთლიანი კონცენტრაცია, რათა იყოს αS კონცენტრაციის ნახევარი.ნაზად, მაგრამ საფუძვლიანად აურიეთ ნიმუშები, რათა დარწმუნდეთ, რომ ისინი ერთგვაროვანია.თითოეული კომპონენტის კონცენტრაცია იცვლებოდა ექსპერიმენტიდან ექსპერიმენტამდე, როგორც აღწერილია შედეგების სექციაში.აზიდი გამოიყენებოდა 0,02% (w/v) კონცენტრაციით, როდესაც ექსპერიმენტის ხანგრძლივობა 4 საათს აღემატებოდა.ყველა ანალიზისთვის LLPS ნიმუშების გამოყენებით, მიეცით ნარევი დაბალანსებული ანალიზამდე 5 წუთით ადრე.სინათლის გაფანტვის ანალიზისთვის, 150 μl ნიმუშები დატვირთეს არასავალდებულო 96 ჭაბურღილის მიკროფილებზე (μClear®, შავი, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, ავსტრია) და დაფარული იყო წებოვანი ფილმით.LLP-ების მონიტორინგი განხორციელდა შთანთქმის გაზომვით 350 ნმ ხსნარის ცენტრში CLARIOstar ფირფიტის მკითხველში (BMG Labtech, ორტენბერგი, გერმანია).ექსპერიმენტები ჩატარდა სამჯერ 25°C ტემპერატურაზე და შეცდომები გამოითვალა როგორც სტანდარტული გადახრა საშუალოდან.განზავებული ფაზა რაოდენობრივად შეფასდა ნიმუშის ცენტრიფუგაციით და SDS-PAGE გელის ანალიზით, და αS ფრაქცია განზავებულ და კონცენტრირებულ ფაზებში რაოდენობრივად იყო განსაზღვრული სხვადასხვა LLPS ხსნარებში.100 μl LLPS ნიმუში, რომელიც შეიცავდა 1 μM AF488-ით ეტიკეტირებულ αS-ს, მომზადდა საფუძვლიანი შერევით, რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგაცია 9600 × გ 30 წუთის განმავლობაში, რის შემდეგაც ნალექი ჩვეულებრივ ხილული იყო.სუპერნატანტის ზედა 50 μl გამოიყენებოდა ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის SDS-PAGE გელის გამოყენებით.გელები დასკანერდა AF488 ფილტრებით ChemiDoc გელის გამოსახულების სისტემის გამოყენებით (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ან შეღებილი იქნა Coomassie ლაქით და ვიზუალიზაცია შესაბამისი ფილტრებით.შედეგად მიღებული ზოლები გაანალიზდა ImageJ ვერსიის 1.53i გამოყენებით (ჯანმრთელობის ეროვნული ინსტიტუტი, აშშ).ექსპერიმენტები ჩატარდა დუბლიკატად ორ სხვადასხვა ექსპერიმენტში მსგავსი შედეგებით.
როგორც წესი, 150 მკლ ნიმუშები გამოყენებული იყო არასავალდებულო 96 ჭაბურღილიანი მიკროფირფიტებზე და ვიზუალიზებული იყო ოთახის ტემპერატურაზე Leica DMI6000B ინვერსიულ მიკროსკოპზე (Leica Microsystems, Wetzlar, გერმანია).ადგილზე ექსპერიმენტებისთვის, μ-Slide Angiogenesis ფირფიტები (Ibidi GmbH, Gräfelfing, გერმანია) ან 96 ჭაბურღილის პოლისტიროლის მიკროფირფიტები (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ასევე გამოიყენებოდა.განათების წყაროდ გამოიყენებოდა EL6000 ჰალოგენის ან ვერცხლისწყლის მეტალის ჰალოიდის ნათურები (შესაბამისად BF/DIC და WF გამოსახულების მისაღებად).WF მიკროსკოპისთვის, 40x გამადიდებელი ჰაერის ობიექტი (Leica Microsystems, გერმანია) გამოიყენეს ნიმუშზე სინათლის ფოკუსირებისთვის და მის შესაგროვებლად.AF488 და ThT ეტიკეტირებული ნიმუშებისთვის, ფილტრის აგზნება და ემისია სტანდარტული GFP ფილტრების ნაკრებით, აგზნების და ემისიის გამტარი ფილტრებით, შესაბამისად, 460–500 ნმ და 512–542 ნმ ზოლიანი ფილტრებით და 495 ნმ დიქრონიკული სარკე.Atto647N-ით ეტიკეტირებული ნიმუშებისთვის გამოყენებული იქნა Cy5 ფილტრების სტანდარტული ნაკრები აგზნების და ემისიის გამტარი ფილტრებით 628–40 ნმ და 692–40 ნმ, შესაბამისად, და 660 ნმ დიქრონიკული სარკე.BF და DIC მიკროსკოპისთვის გამოიყენეთ იგივე არეკლილი სინათლის შეგროვების ობიექტი.შეგროვებული შუქი ჩაიწერა Leica DFC7000 CCD კამერაზე (Leica Microsystems, გერმანია).ექსპოზიციის დრო იყო 50 ms BF და DIC მიკროსკოპული გამოსახულების და 20-100 ms WF მიკროსკოპული გამოსახულების დროს.შედარებისთვის, ThT-ის ყველა ექსპერიმენტისთვის ექსპოზიციის დრო იყო 100 ms.ტაიმ-ლაფსის ექსპერიმენტები ჩატარდა წვეთების შერწყმის ვიზუალიზაციისთვის, სურათები გროვდებოდა ყოველ 100 ms-ში რამდენიმე წუთის განმავლობაში.გამოსახულების ანალიზისთვის გამოიყენეს ImageJ (NIH, აშშ).ექსპერიმენტები ჩატარდა სამჯერ მსგავსი შედეგებით.
კოლოკალიზაციის ექსპერიმენტებისთვის, FRAP და 3D რეკონსტრუქციისთვის, სურათები იქნა მიღებული Zeiss LSM 880 ინვერსიულ კონფოკალურ მიკროსკოპზე ZEN 2 ლურჯი გამოცემის გამოყენებით (Carl Zeiss AG, Oberkochen, გერმანია).50 μl ნიმუშები გამოყენებული იქნა μ-Slide Angiogenesis Petri ჭურჭელზე (Ibidi GmbH, Gröfelfing, გერმანია), დამუშავებული ჰიდროფილური პოლიმერით (ibiTreat) და დამონტაჟებული 63× ზეთის ჩაძირვის ობიექტში (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 ზეთი). DIC-ზე).სურათები მიღებულია 458 ნმ, 488 ნმ და 633 ნმ არგონის ლაზერული ხაზების გამოყენებით, გარჩევადობით 0,26 μm/პიქსელი და ექსპოზიციის დრო 8 μs/პიქსელი აგზნების და ემისიის გამოვლენის ფანჯრებისთვის 470–600 ნმ, 493–628 ნმ. და 638-755 ნმ გამოიყენეს ThT, AF488 და Atto647N ვიზუალიზაციისთვის, შესაბამისად.FRAP ექსპერიმენტებისთვის, თითოეული ნიმუშის დროითი გადაღება ჩაწერილი იყო 1 კადრი წამში.ექსპერიმენტები ჩატარდა სამჯერ ოთახის ტემპერატურაზე მსგავსი შედეგებით.ყველა სურათი გაანალიზდა Zen 2 blue edition პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (Carl Zeiss AG, Oberkochen, გერმანია).FRAP მრუდები იყო ნორმალიზებული, გამოსახული და დაყენებული ინტენსივობის/დროის მონაცემებზე, რომლებიც ამოღებულ იქნა სურათებიდან Zen 2-ის გამოყენებით OriginPro 9.1-ის გამოყენებით.აღდგენის მრუდები დამონტაჟდა მონო-ექსპონენციალურ მოდელზე მოლეკულური დიფუზიის გასათვალისწინებლად დამატებითი ექსპონენციური ტერმინით შეძენის გაუფერულების ეფექტის გასათვალისწინებლად.შემდეგ ჩვენ გამოვთვალეთ D ნომინალური გაუფერულების რადიუსის და ადრე განსაზღვრული აღდგენის ნახევარგამოყოფის პერიოდის გამოყენებით, როგორც Kang et al-ის განტოლებაში.5 35 ნაჩვენებია.
αS-ის ერთჯერადი ცისტეინის ვარიანტები სინთეზირებული იყო 4-ჰიდროქსი-2,2,6,6-ტეტრამეთილპიპერიდინ-N-ოქსილთან (TEMPOL) პოზიციებზე 24 (TEMPOL-24-αS) და 122 (TEMPOL-122-αS), შესაბამისად.Spin Labeling EPR ექსპერიმენტებისთვის αS კონცენტრაცია დაყენებული იყო 100 μM-ზე და PEG კონცენტრაცია იყო 15% (w/v).სხვადასხვა აგრეგაციის პირობებისთვის, αS:pLK თანაფარდობა იყო 1:10, ხოლო αS:ΔNt-Tau და αS:Tau441 შეფარდება შენარჩუნებული იყო 1:1-ზე.შებოჭვის ტიტრაციის ექსპერიმენტებისთვის ხალხმრავლობის არარსებობის შემთხვევაში, TEMPOL-122-αS შენარჩუნებული იყო 50 μM-ზე და პოლიკათიონები ტიტრირებულ იქნა მზარდი კონცენტრაციით, თითოეული პირობის ცალკე მომზადება.CW-EPR გაზომვები ჩატარდა Bruker ELEXSYS E580 X-ზოლიანი სპექტრომეტრის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო Bruker ER4118 SPT-N1 რეზონატორით, რომელიც მუშაობს მიკროტალღურ (SHF) სიხშირეზე ~ 9,7 გჰც.ტემპერატურა დაყენებული იყო 25°C-ზე და კონტროლდებოდა თხევადი აზოტის კრიოსტატით.სპექტრები მიღებულ იქნა უჯერი პირობებში 4 მვტ სიმძლავრის, მოდულაციის ამპლიტუდის 0.1 მტ და მოდულაციის სიხშირის 100 კჰც.სპექტრული ინტენსივობა იყო ნორმალიზებული, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნიმუშებს შორის სპინის კონცენტრაციებში განსხვავებები და სპინის შესაძლო შემცირების გამო შემცირების აგენტების ნარჩენი კონცენტრაციების გამო ნიმუშებში, რომლებიც შეიცავს Tau441 ან ΔNt-Tau-ს (არსებობს ორიგინალური ცილის ხსნარებში).g-ის მოცემული მნიშვნელობები მიღებულ იქნა Matlab®67-ში განხორციელებული Easyspin პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (v. 6.0.0-dev.34) EPR სპექტრალური მოდელირების შედეგად.მონაცემთა მოდელირებისთვის გამოყენებული იყო ერთი/ორი კომპონენტის იზოტროპული მოდელები.ყველა სიგნალის ნორმალიზების შემდეგ, ნარჩენები გამოითვალა თითოეული სიმულაციის გამოკლებით შესაბამისი ექსპერიმენტული სპექტრიდან.შებოჭვის ტიტრირების ანალიზისთვის, მესამე ზოლის ფარდობითი ინტენსივობა ნორმალიზებული EPR სპექტრის მეორე ზოლთან (IIII/III) გამოყენებული იყო αS-თან პოლიკათიონების შეკავშირების მონიტორინგისთვის.დისოციაციის მუდმივის (Kd) შესაფასებლად, მიღებული მრუდი დამონტაჟდა მიახლოებით მოდელზე, რომელიც ითვალისწინებს n იდენტურ და დამოუკიდებელ შეკვრის ადგილს.
NMR სპექტროსკოპიის ექსპერიმენტები ჩატარდა Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR სპექტრომეტრით, რომელიც აღჭურვილი იყო კრიოზონდით და Z-გრადიენტით.ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა 130-207 μM αS და შესაბამისი αS/ΔNt-Tau და pLK ეკვივალენტების გამოყენებით 10 მმ HEPES, 100 მმ NaCl, 10% DO, pH 7.4 და ჩატარდა 15°C-ზე.LPS NMR-ით მონიტორინგისთვის, წინასწარ შერეულ ნიმუშებს დაემატა 10% PEG.ქიმიური ცვლის პერტურბაციის დიაგრამა (ნახ. 1ბ) გვიჩვენებს საშუალო 1H და 15N ქიმიურ ძვრებს.αS 2D1H-15N HSQC სპექტრები მინიჭებული იქნა წინა მინიჭების საფუძველზე (BMRB ჩანაწერი #25227) და დადასტურდა HNCA, HNCO და CBCAcoNH 3D სპექტრების ჩაწერით და ანალიზით.13Cα და 13Cβ ქიმიური ძვრები გამოითვლებოდა ΔNt-Tau ან pLK-ის თანდასწრებით, რათა გავზომოთ შესაძლო ცვლილებები მეორადი სტრუქტურის ტენდენციებში αS ქიმიურ ძვრებთან შედარებით სუფთა შემთხვევითი კოჭის კონფორმაციაში 68 (დამატებითი სურათი 5c).R1ρ სიხშირე გაზომილი იყო hsqctretf3gpsi ექსპერიმენტების ჩაწერით (მიღებული ბრუკერის ბიბლიოთეკიდან) დაგვიანებით 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 და 800 ms და ექსპონენციალური ფუნქციები მორგებული იყო დაყოვნების პიკზე სხვადასხვა კუთხით. ჯერ, რათა დადგინდეს R1ρ და მისი ექსპერიმენტული გაურკვევლობა.
ორფერიანი დროში გამხსნელი ფლუორესცენციული მიკროსკოპის ექსპერიმენტები ჩატარდა კომერციულ დროში გამხსნელ MT200 ფლუორესცენტურ კონფოკალურ მიკროსკოპზე (PicoQuant, ბერლინი, გერმანია) დროში კორელირებული ერთი ფოტონების დათვლის მოწყობილობით (TCSPC).ლაზერული დიოდის თავი გამოიყენება იმპულსური ინტერვალებით აღგზნებისთვის (PIE), სხივი გადის ერთ რეჟიმის ტალღის გამტარში და მორგებულია ლაზერის სიმძლავრეზე 10-დან 100 ნვტ-მდე 481 ნმ და 637 ნმ ლაზერული ხაზებისთვის, რომლებიც იზომება დიქრონიკული სარკის შემდეგ.ეს უზრუნველყოფს ფოტონების დათვლის ოპტიმალურ სიჩქარეს, თავიდან აიცილებს ფოტონების ალიასირების, ფოტოგათეთრებისა და გაჯერების ეფექტებს.μ-სლაიდების ანგიოგენეზის გადასაფარებლები ან ფირფიტები (Ibidi GmbH, Gräfelfing, გერმანია) მოთავსებული იყო უშუალოდ ჩაძირვის წყალში Super Apochromat 60x NA 1.2 ლინზაზე მაკორექტირებელი საყელოთი (Olympus Life Sciences, Waltham, აშშ).მთავარი სხივის გამყოფად გამოიყენებოდა 488/640 ნმ დიქროული სარკე (Semrock, Lake Forest, IL, USA).არაფოკუსირებული გამოსხივება იკეტება 50 მიკრონი დიამეტრის ნახვრეტით, შემდეგ ფოკუსირებული გამოსხივება იყოფა 2 გამოვლენის გზად 50/50 სხივის გამყოფით.დეტექტორის წინ გამოყენებული იყო გამტარი ემისიის ფილტრები (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 მწვანე საღებავისთვის (AF488) და 690/70 წითელი საღებავისთვის (Atto647N).დეტექტორად გამოიყენებოდა ერთფოტონიანი ზვავის დიოდები (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy).მონაცემთა შეგროვება და ანალიზი განხორციელდა კომერციულად ხელმისაწვდომი SymphoTime64 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (PicoQuant GmbH, ბერლინი, გერმანია).
ორმოცდაათი მიკროლიტრი LLPS ნიმუში იქნა გამოყენებული μ-Slide ანგიოგენეზის ჭაბურღილებზე (Ibidi GmbH, Gräfelfing, გერმანია).შედეგად მიღებული სურათები ფოკუსირებულია 20 μm-ზე ჭაბურღილის ფსკერის ზემოთ, ოპტიმალური ობიექტური სამუშაო მანძილისთვის შეჩერებული წვეთებისთვის და ~1 μm-მდე რაფტებისთვის და წერტილებისთვის, ღერძული გარჩევადობით მინიმუმ 0,25 μm/pixel და დაყოვნების დრო 400 μs/pixel.აირჩიეთ მონაცემები ინტენსივობის ზღურბლის გამოყენებით, რომელიც დაფუძნებულია ფონური სიგნალის საშუალო ინტენსივობაზე (PBG, საშუალო + 2σ) თითოეული არხისთვის ისე, რომ შეირჩეს მხოლოდ თხევადი ცილის წვეთები, რაფები ან ლაქები, გაფილტრული ნებისმიერი შესაძლო წარმოშობის დისპერსიული ფაზიდან.თითოეული არხის თითოეული სახეობის (τ) სიცოცხლის ხანგრძლივობის გასაანალიზებლად (მწვანე, "g" AF488-ისთვის და წითელი, "r" Atto647N-ისთვის), ჩვენ შევარჩიეთ საინტერესო რეგიონები (ROIs), რომლებიც შეიცავს წვეთებს, ჯოხებს ან ლაქებს (დამატებითი სურათი 1. ).8b) და მიღებულია ისინი მათი სიცოცხლის განმავლობაში დაშლის (τD, τR და τP წვეთებისთვის, ჯოხებით ან ლაქებისთვის, შესაბამისად, იხილეთ დამატებითი ნახ. 8c) თითოეულ არხში კუდის მორგების ანალიზის და ორკომპონენტიანი დაშლის მოდელის გამოყენებით.საშუალო τ-დან τ.ROI-ები, რომლებიც წარმოქმნიდნენ ძალიან ცოტა ფოტონს მრავალ ექსპონენციური მორგებისთვის, გამოირიცხა ანალიზიდან.გამოყენებული წყვეტა იყო <104 ფოტონი რაფებისთვის და წერტილებისთვის და 103 წვეთებისთვის.წვეთებს აქვთ უფრო დაბალი ბარიერი, რადგან ძნელია დაშლის მრუდების მიღება უფრო მაღალი ინტენსივობის მნიშვნელობებით, რადგან გამოსახულების ველში წვეთები, როგორც წესი, უფრო მცირე და მრავალრიცხოვანია.ROI-ები, სადაც ფოტონების რაოდენობა აღემატება ფოტონების დაგროვების ლიმიტს (დაყენებულია >500 რაოდენობა/პიქსელზე) ასევე გაუქმდა ანალიზისთვის.შეადარეთ ინტერესის რეგიონიდან მიღებული ინტენსივობის დაშლის მრუდი ინტენსივობით მაქსიმუმის 90%-ზე (დაშლის მაქსიმალური ინტენსივობის შემდეგ ოდნავ შემდეგ) მომსახურების ვადის დაწყებიდან, რათა უზრუნველყოთ მინიმალური IRF ჩარევა და შენარჩუნდეს იგივე ყველა ინტენსივობის დაშლის დროს. პარამეტრები შედარებითი დროის ფანჯარა გაანალიზებული იყო 25-დან 50 ROI-მდე რაფტებისთვის და ლაქებისთვის და 15-25 ROI წვეთებისთვის, სურათები არჩეული იყო 4-ზე მეტი რეპლიკიდან, ჩაწერილი მინიმუმ 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.ორკუდიანი t-ტესტები გამოყენებულია სტატისტიკური განსხვავებების შესაფასებლად სახეობებს შორის ან კოაცერვატულ სისტემებს შორის.სიცოცხლის ხანგრძლივობის პიქსელ-პიქსელური ანალიზისთვის (τ), გამოითვალა სიცოცხლის ხანგრძლივობის ჯამური შესუსტება ველზე თითოეული არხისთვის და განხორციელდა 2/3-კომპონენტიანი ექსპონენციური შესუსტების მოდელის მიახლოება.თითოეული პიქსელისთვის სიცოცხლის ხანგრძლივობის შესუსტება დაყენებული იყო ადრე გამოთვლილი τ მნიშვნელობების გამოყენებით, რის შედეგადაც მიიღება ფსევდოფერადი FLIM მორგებული სურათი.კუდის მორგების სიცოცხლის დიაპაზონი იგივე იყო ერთი და იმავე არხის ყველა სურათზე და ყოველი დაშლა წარმოქმნიდა საკმარის ფოტონებს საიმედო მორგების უზრუნველსაყოფად.FRET ანალიზისთვის პიქსელები შეირჩა 100 ფოტონის ქვედა ინტენსივობის ზღურბლის გამოყენებით, რომელიც საშუალოდ ასახავს ფონური სიგნალს (FBG) 11 ფოტონს.თითოეული არხის ფლუორესცენციის ინტენსივობა შესწორებული იყო ექსპერიმენტულად განსაზღვრული კორექტირების ფაქტორებით: 69 სპექტრული ჯვარედინი α იყო 0,004, პირდაპირი აგზნების β იყო 0,0305, გამოვლენის ეფექტურობა γ იყო 0,517.შემდეგ პიქსელის დონეზე FRET ეფექტურობა გამოითვლება შემდეგი განტოლების გამოყენებით:
სადაც FDD არის დონორის (მწვანე) არხში დაფიქსირებული ფლუორესცენციის ინტენსივობა, FDA არის ფლუორესცენციის ინტენსივობა, რომელიც შეინიშნება მიმღების (წითელ) არხში არაპირდაპირი აგზნების დროს და FAA არის ფლუორესცენციის ინტენსივობა, რომელიც შეინიშნება მიმღებ (წითელ) არხში პირდაპირი აგზნების დროს ( PIE).არხში შეინიშნება ფლუორესცენციის ინტენსივობის პულსები).
მოათავსეთ 100 μl LLPS რეაქციის ხსნარი, რომელიც შეიცავს 25 μM არალეიბლირებულ მონომერულ Tau441-ს (25 μM αS-ით ან მის გარეშე) LLPS ბუფერში (დამატებულია როგორც ზემოთ) არასავალდებულო 96 ჭაბურღილზე წებოვანი ფოლგის საფარით და წვეთების წარმოქმნა შემოწმდა WF მიკროსკოპით. წონასწორობა.10 წუთის განმავლობაში.ოთახის ტემპერატურაზე ინკუბაციიდან 48 საათის შემდეგ დადასტურდა ცილის რაფებისა და ლაქების არსებობა.შემდეგ ფრთხილად ამოიღეთ სითხე ჯოხებიდან ჭაბურღილებიდან, შემდეგ დაამატეთ 50 ლ დისოციაციის ბუფერი (10 მმ HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 მმ DTT) და ინკუბაცია 10 წუთის განმავლობაში.მარილის მაღალი კონცენტრაცია უზრუნველყოფს, რომ LLPS არ განმეორდება ნარჩენი PEG-ის გამო და მხოლოდ ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების შედეგად წარმოქმნილი ცილების შესაძლო შეკრებები დაიშლება.ჭაბურღილის ფსკერი შემდეგ ფრთხილად გაიფხეკა მიკროპიპეტის წვერით და მიღებული ხსნარი გადაიტანეს ცარიელ სადამკვირვებლო ჭაში.ნიმუშების ინკუბაციის შემდეგ 50 μM ThT 1 საათის განმავლობაში, იზოლირებული ლაქების არსებობა შემოწმდა WF მიკროსკოპით.მოამზადეთ სონიკირებული αS ფიბრილები 300 μl 70 μM αS ხსნარის ინკუბაციით PBS-ში pH 7.4, ნატრიუმის აზიდი 0.01% 37 °C-ზე და 200 rpm ორბიტალურ შეკერზე 7 დღის განმავლობაში.შემდეგ ხსნარი ცენტრიფუგირებულ იქნა 9600×გრ-ზე 30 წუთის განმავლობაში, მარცვლები ხელახლა შეჩერდა PBS pH 7.4-ში და გაჟღენთილი (1 წთ, 50% ციკლი, 80% ამპლიტუდა Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) ფიბრილის ნიმუშებში. მცირე ფიბრილების შედარებით ერთგვაროვანი ზომის განაწილებით.
FCS/FCCS ანალიზი და ორი ფერის დამთხვევის გამოვლენა (TCCD) ჩატარდა იმავე MT200 დროში გამხსნელ ფლუორესცენტურ კონფოკალურ მიკროსკოპზე (Pico-Quant, ბერლინი, გერმანია), რომელიც გამოიყენება FLIM-FRET მიკროსკოპის ექსპერიმენტებისთვის PIE რეჟიმის გამოყენებით.ამ ექსპერიმენტებისთვის ლაზერის სიმძლავრე დაემატა 6.0 μW (481 ნმ) და 6.2 μW (637 ნმ).ამ ლაზერული სიმძლავრის კომბინაცია არჩეულ იქნა მსგავსი სიკაშკაშის შესაქმნელად გამოყენებული ფტორფორების წყვილებისთვის, ოპტიმალური დათვლის სიჩქარის მისაღწევად და ფოტოგათეთრებისა და გაჯერების თავიდან ასაცილებლად.მონაცემთა შეგროვება და ანალიზი განხორციელდა კომერციულად ხელმისაწვდომი SymphoTime64 ვერსიის 2.3 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (PicoQuant, ბერლინი, გერმანია).
LLPS-ის გამოყენებით მიღებული იზოლირებული αS/Tau აგრეგატების ნიმუშები განზავებულია საიზოლაციო ბუფერში შესაბამის მონომოლეკულურ კონცენტრაციამდე (ჩვეულებრივ განზავება 1:500, ვინაიდან აგრეგატები უკვე დაბალ კონცენტრაციებშია, როდესაც იზოლირებულია კოაცერვატის ნიმუშებიდან).ნიმუშები გამოყენებული იქნა პირდაპირ გადასაფარებლებზე (კორნინგი, აშშ) წინასწარ დაფარული BSA ხსნარით 1 მგ/მლ კონცენტრაციით.
მწვანე და წითელ არხებში PIE-smFRET ანალიზისთვის გამოყენებული იყო 25 ფოტონის დაბალი ინტენსივობის ბარიერი მონომერული მოვლენებით გამოწვეული დაბალი ინტენსივობის სიგნალების გასაფილტრად (გაითვალისწინეთ, რომ მონომერები აღემატება გაერთიანებულ ნიმუშებს იზოლირებულ აგრეგატებთან შედარებით).ეს ზღვარი გამოთვლილი იყო, როგორც ხუთჯერ მეტი მონომერული αS-ის საშუალო ინტენსივობა, რომელიც მიღებული იყო სუფთა მონომერის ნიმუშების ანალიზით, რათა კონკრეტულად შერჩეულიყო ანალიზისთვის აგრეგატები.PIE დისკის წრემ, TSCPC მონაცემების მიღებასთან ერთად, ჩართო უწყვეტი წონის ფილტრის გამოყენება, რომელიც ეხმარება აღმოფხვრას ფონური და სპექტრული ჯვარი.ზემოაღნიშნული ზღვრების გამოყენებით შერჩეული აფეთქების ინტენსივობა გამოსწორდა საშუალო ფონური სიგნალის გამოყენებით, რომელიც განისაზღვრება მხოლოდ ბუფერული ნიმუშების ინტენსივობის/ბინის ჰისტოგრამებიდან.დიდ აგრეგატებთან დაკავშირებული აფეთქებები, როგორც წესი, იკავებს რამდენიმე თანმიმდევრულ ურნას დროის კვალში (დაყენებულია 1 ms-ზე).ამ შემთხვევებში არჩეული იყო მაქსიმალური სიმტკიცის ურნა.FRET და სტექიომეტრიული ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა თეორიულად განსაზღვრული გამა ფაქტორი γ (0.517).სპექტრული ჯვარედინი და პირდაპირი აგზნების წვლილი უმნიშვნელოა (განსაზღვრულია ექსპერიმენტულად) გამოყენებული აგზნების ლაზერის სიმძლავრეზე.FRET-ის ეფექტურობა და სტექიომეტრია აფეთქებაში გამოითვლება შემდეგნაირად.