347 უჟანგავი ფოლადის დახვეული მილის ქიმიური კომპონენტი, ახალი ინტერფერონზე პასუხისმგებელი ადამიანის ლეიკოციტების ანტიგენ-A (HLA-A) ჩაპერონის ცილების იდენტიფიკაცია ჯვარედინი მასის სპექტრომეტრიის გამოყენებით (CLMS)

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
სლაიდერები, რომლებიც აჩვენებს სამ სტატიას თითო სლაიდზე.გამოიყენეთ უკანა და შემდეგი ღილაკები სლაიდებში გადასაადგილებლად, ან სლაიდის კონტროლერის ღილაკები ბოლოს თითოეულ სლაიდში გადასაადგილებლად.

პროდუქტის აღწერა

უჟანგავი ფოლადის 347L Coil მილები, ფოლადის ხარისხი: SS347L

ინტერფერონის სასიგნალო სისტემა იწვევს ძლიერ ციტოკინურ რეაქციას გარემოდან პათოგენური და შინაგანი პათოლოგიური სიგნალების ფართო სპექტრზე, რაც იწვევს ინტერფერონის ინდუქციური ცილების ქვეჯგუფების ინდუქციას.ჩვენ გამოვიყენეთ DSS შუამავლობით ჯვარედინი ბმულის მასის სპექტრომეტრია (CLMS) ცილა-პროტეინის ახალი ურთიერთქმედების გამოსავლენად ინტერფერონით ინდუცირებული ცილების დომენში.გარდა მოსალოდნელი ინტერფერონის ინდუქციური ცილების, ჩვენ ასევე გამოვავლინეთ ახალი ინტერმოლეკულური და ინტრამოლეკულური ჯვარედინი შეერთება კანონიკური ინტერფერონის ინდუცირებადი ცილების, როგორიცაა MX1, USP18, OAS3 და STAT1.ჩვენ ყურადღება გავამახვილეთ ინტერფერონის ინდუცირებადი ცილოვანი ქსელების ახალი ნაკრების ორთოგონალურ ვალიდაციაზე, რომლებიც წარმოიქმნება HLA-A ცილებით (H2BFS-HLA-A-HMGA1) თანაიმუნოპრეციპიტაციის გამოყენებით და მათ შემდგომ შესწავლაზე მოლეკულური დინამიკის მოდელირების გამოყენებით.ცილის კომპლექსის კონფორმაციული დინამიკის მოდელირებამ გამოავლინა რამდენიმე ურთიერთქმედების ადგილი, რომლებიც ასახავდნენ CLMS-ის დასკვნებში გამოვლენილ ურთიერთქმედებებს.ჩვენ ერთად წარმოგიდგენთ CLMS-ის საპილოტე კვლევას ინტერფერონის მიერ გამოწვეული ახალი სასიგნალო კომპლექსების იდენტიფიცირებისთვის და ველით CLMS-ის ფართო გამოყენებას სიმსივნის მიკროგარემოში ცილოვანი ურთიერთქმედების ახალი დინამიკის დასადგენად.
სანამ ადაპტური იმუნური პასუხი დაიწყება, მასპინძლის თანდაყოლილი თავდაცვითი სისტემა აყალიბებს ანტიმიკრობულ პასუხს, რომელიც შუამავლობს სეკრეტირებული ალფა-სპირალური ციტოკინების ოჯახით, რომელსაც ეწოდება ინტერფერონები (IFNs).I ტიპის IFN კლასები IFNα და IFNβ ააქტიურებენ უჯრედულ პასუხებს, მათ შორის ანტივირუსულ, პროაპოპტოზურ, პროანთებით და ანტიპროლიფერაციულ მდგომარეობებს.ადამიანებში ცნობილია IFNα-ს 13 ქვეტიპი, ყველა დაჯგუფებულია 91-ე ქრომოსომაზე. გასაკვირია, რომ მხოლოდ IFNα2 იყო შესწავლილი კლინიკური გამოყენებისთვის.ბოლო დროს განსაკუთრებული ყურადღება დაეთმო კვლევას IFNα-ს სხვა ქვეტიპებზე.ბოლოდროინდელმა კვლევამ აჩვენა, რომ IFNα14 არის ერთ-ერთი ყველაზე ეფექტური იზოფორმა HBV2 და HIV-13,4 რეპლიკაციის შეზღუდვისთვის, კანონიკურ IFNα2 ქვეტიპთან შედარებით.
დადგენილია, რომ I ტიპის ინტერფერონის რეცეპტორების გააქტიურებული კომპლექსები (IFNAR1 და IFNAR2) იწვევს სიგნალის გადაცემის კასკადს, შუამავლობით Janus kinases TYK2 და JAK15,6.ეს იანუს კინაზები ფოსფორილატებენ სიგნალის გადამყვანებს და ტრანსკრიპციული ცილის აქტივატორებს (STAT1 და STAT2) ტიროზინის ნარჩენებზე, რათა დაიწყოს SH2 დომენის შუამავლობით გამოწვეული ჰეტეროდიმერიზაცია6.შემდგომში, IRF9 აკავშირებს STAT ჰეტეროდიმერებს, რათა წარმოქმნას IFN-სტიმულირებული ფაქტორი 3 გენის ტრიმერული კომპლექსი (ISGF3), რომელიც გადადის ბირთვში და იწვევს 2000-ზე მეტი ინტერფერონის სტიმულირებული გენის (ISGs) ტრანსკრიფციას 5,6,7,8.
ISG-ები ქმნიან თანდაყოლილი იმუნური სისტემის ხერხემალს, განსაკუთრებით ვირუსული შეტევის საპასუხოდ.როგორც ვირუსული ინფექციის წინააღმდეგ თავდაცვის პირველი ხაზი, უჯრედები სწრაფად ახორციელებენ უჯრედული ცილების ვრცელ ურთიერთქმედებას ბიოლოგიური აქტივობების ფართო სპექტრით.ეს პროტეინები მოიცავს ნიმუშის ამომცნობ რეცეპტორებს, სასიგნალო მოლეკულებს, ტრანსკრიფციის ფაქტორებს და პროტეინებს პირდაპირი ანტივირუსული ფუნქციებით, ასევე იმუნური პასუხების უარყოფით რეგულატორებს9.ISG აქტივობის შესახებ ინფორმაციის დიდი ნაწილი მომდინარეობს ფუნქციური ეკრანებიდან, რომლებიც იყენებენ გადაჭარბებული გამოხატვის ეკრანებს10,11 ან გენის დუმილის ტექნიკას (siRNA, RNAi და CRISPR)12,13, რომლებშიც ინდივიდუალური ISG-ები გამოხატულია ან ინჰიბირდება და მათი აქტივობა ტესტირება ხდება სხვადასხვა ვირუსებზე.მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევებმა დაადგინა ინდივიდუალური ISG-ის ანტივირუსული თვისებები, თითოეული ISG-ის ძირითადი მოლეკულური მექანიზმები ძირითადად უცნობია.ზოგადად მიღებულია, რომ ბევრი ცილა ურთიერთქმედებს ერთ ან მეტ ციტოკინთან სრული აქტივობის უზრუნველსაყოფად, ამიტომ ან ISG-ები ურთიერთქმედებენ უშუალოდ, ან მათი ურთიერთქმედება ხდება უჯრედული პროტეინებით.მაგალითად, ბოლოდროინდელმა ფოტოჯვარედინი პროტეომიკის კვლევამ გამოავლინა ATPase VCP/p97, როგორც IFITM3 ურთიერთქმედების მთავარი პარტნიორი, რომლის დათრგუნვა იწვევს IFITM3-ის ვირუსულ ნაწილაკებთან ლიზოსომური დახარისხების, ბრუნვისა და კოტრანსპორტის დეფექტებს 14 .იმუნოპრეციპიტაციის გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ VAPA, ვეზიკულასთან ასოცირებული ცილა, როგორც ურთიერთქმედების პარტნიორი IFITM1/2/3-თან, რომელიც შუამავლობს ქოლესტერინის შუამავლობით ვირუსულ მომწიფებას, და ეს დადასტურდა სხვა კვლევით, საფუარის ორი ჰიბრიდული სისტემის გამოყენებით.სამეცნიერო მხარდაჭერა 15 , 16 .
ფუნდამენტური ბიოლოგიური პროცესი, რომელიც ჩართულია ინფექციის და ავთვისებიანი ტრანსფორმაციის ჩახშობაში, არის ანტიგენის პრეზენტაცია, რომელიც შუამავლობს ძირითადი ჰისტოშეთავსებადობის კომპლექსის (MHC) მოლეკულებით.პეპტიდები (8-12 ამინომჟავის სიგრძე) დაშლილი, ნაადრევად შეწყვეტილი ან არასწორად დაკეცილი ცილებიდან იტვირთება MHC-I ჰეტეროდიმერში (შედგება MHC-I მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვებისაგან, რომელსაც ეწოდება β-2-მიკროგლობულინი; β2M) 17,18.შედეგად მიღებული სტაბილური MHC-I ტრიმერები ტრანსპორტირდება უჯრედის ზედაპირზე, სადაც ისინი წარმოადგენენ უჯრედშიდა პეპტიდებს CD8+ T უჯრედებში (ციტოტოქსიური T უჯრედები)17.T უჯრედები ამოიცნობენ და ანადგურებენ ამ პათოგენებს და უჯრედებს, რომლებიც ატარებენ სიმსივნის სპეციფიკურ ანტიგენს.შესაბამისად, პათოგენები და სიმსივნური უჯრედები ხშირად თრგუნავენ ანტიგენის წარმოდგენის პროცესს იმუნური მეთვალყურეობის თავიდან ასაცილებლად.გარდა ამისა, MHC-I დაქვეითებულია ადამიანის სიმსივნეების 40-90%-ში და ხშირად ასოცირდება ცუდ პროგნოზთან19.
გენები, რომლებიც მონაწილეობენ პათოგენებზე რეაგირებაში, სწრაფად უნდა გადავიდნენ მოსვენების მდგომარეობასა და აქტიური ტრანსკრიფციის მდგომარეობას შორის.აქედან გამომდინარე, რამდენიმე ფიჭური ცილა ვარაუდობს, რომ ჩართულია IFN-ის მაღალ მოთხოვნაზე რეაგირებაში მოკლე დროში, მათ შორის პრომოტორ ქრომატინის რემოდელირებასა და მოდიფიკაციაში 20,21.კვლევების უმეტესობა ფოკუსირებულია ინდივიდუალური ISG პროტეინის პარტნიორების იდენტიფიკაციაზე IFN-ის თანდასწრებით.რამდენიმე პროტეომიურმა და ტრანსკრიპტომურმა კვლევამ სამოდელო უჯრედულ სისტემებში გაარკვია IFN-ის ეფექტი უჯრედულ ლანდშაფტზე.თუმცა, ინტერფერონებით გამოწვეული დინამიკის მზარდი გაგების მიუხედავად, ჩვენ ჯერ კიდევ ცოტა ვიცით ISG-ების ჩართულობის შესახებ.ინტერფერონის სიგნალიზაციის სირთულის და დროზე დამოკიდებული დინამიკის განხილვისას ჩნდება ორი კითხვა: (i) შესაძლებელია თუ არა სტაბილიზირება და მულტიპროტეინების კომპლექსების დაჭერა, რომლებიც ჩართულია სწრაფ სიგნალიზაციაში, და (ii) შეიძლება თუ არა ამ ურთიერთქმედების 3D სივრცეში დაფიქსირება?
ამ საკითხების გადასაჭრელად, ჩვენ განვახორციელეთ დისკუცინიმიდის სუბერატით შუამავლობითი ქიმიური ჯვარედინი კავშირი (DSS) და მასობრივი სპექტრომეტრია (CLMS), რათა შეგვესწავლა IFNα-ის გამოწვეული პროტეინის ურთიერთქმედების ქსელი და მისი დინამიკა.DSS ამატებს კოვალენტურ კავშირებს ცილების პროქსიმალურ ნარჩენებს და/ან ცილოვან კომპლექსებს შორის in vivo.შემდგომი MS ანალიზი ავლენს სპეციფიკურ ჯვარედინი უბნებს, რომლებიც ასახავს რეგიონების სივრცით სიახლოვეს კონკრეტულ პროტეინში, რომელსაც ეწოდება შიდა კავშირები, ან ქვედანაყოფები ცილოვან კომპლექსებში, რომელსაც ეწოდება ურთიერთდამოკიდებულება.ამ მიდგომის გამოყენებით, ჩვენ გამოვავლინეთ რამდენიმე ახალი ცილა-პროტეინის კომპლექსი, ისევე როგორც ინტერფერონით გამოწვეული მრავალპროტეინის ურთიერთქმედების ქსელები.ამ ახალი ურთიერთქმედებების ქვეჯგუფის შემდგომი ტესტირებით, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ H2BFS (H2B ჰისტონის ტიპის FS; შემდგომში H2B) და MDN1 მოქმედებენ როგორც HLA-A-ს დამაკავშირებელი პარტნიორები.
Flo-1 უჯრედები საყლაპავის ადენოკარცინომის ერთ-ერთი ყველაზე ცნობილი ინ ვიტრო მოდელია, რადგან ისინი ბაძავენ საყლაპავის სიმსივნეების ძირითად მახასიათებლებს22,23.თუმცა, ყველა სიმსივნე არ არის იმუნოგენური და იმის დასადგენად, რეაგირებს თუ არა Flo-1 უჯრედები ინტერფერონის მკურნალობაზე, ჩვენ ვუმკურნალეთ Flo-1 უჯრედებს 10 ნგ/მლ IFNα 72 საათის განმავლობაში.Flo-1 უჯრედებმა აჩვენეს pSTAT1 და IRF1 ადრეული ინდუქცია, დაწყებული მკურნალობიდან 2 საათის შემდეგ და გაგრძელდა 72 საათის განმავლობაში, დროზე დამოკიდებული IRF1 სტაციონარული დონის შემცირებით (სურათი 1A).აღმოჩნდა, რომ ISG-ები (MX1, IFITM1, OAS1/2 და ISG15) ძლიერ ინდუცირებული იყო 6 საათის შემდეგ, IFNα-ზე კლასიკური შუა და გვიანი ფაზის პასუხების მიბაძვით (სურათი 1A).ეს მონაცემები ერთად ვარაუდობს, რომ ეს უჯრედული მოდელი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ინტერფერონის რეაქციების შესასწავლად.
ცილის დიფერენციალური გამოხატვის პასუხები Flo-1 უჯრედებში IFNα მკურნალობის შემდეგ.(A) ცილის ექსპრესია Flo-1 უჯრედებში დამუშავებულ 10 ნგ/მლ IFNα 2, 6, 24, 48 და 72 საათის განმავლობაში გაანალიზებული იყო იმუნობლოტით მითითებული ISG ანტისხეულების გამოყენებით.(B) Coomassie ლურჯი შეღებილი SDS-PAGE გელები მთლიანი უჯრედის ექსტრაქტებისგან DSS-თან ჯვარედინი დაკავშირების შემდეგ მითითებული დროებისა და კონცენტრაციებისთვის.(C) წარმომადგენლობითი იმუნობლოტი, გამოკვლეული p53(DO-1) ანტისხეულით იმავე ნიმუშებიდან, რათა შეფასდეს ცილის ჯვარედინი კავშირის ხარისხი.
ცილის in situ ურთიერთქმედების ლანდშაფტის დასაფიქსირებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ DSS, ფართოდ გამოყენებული ჯვარედინი დამაკავშირებელი აგენტი მისი მაღალი მემბრანის გამტარიანობისა და შედარებით მოკლე რეაქციის დროის გამო.რეაქციის ხანმოკლე დრო ხელს უწყობს ჯვარედინი კავშირში მყოფი ცილების დიდი აგრეგატების წარმოქმნის თავიდან აცილებას, რითაც ინარჩუნებს კროსლინკერის სტაბილურობას.DSS ოპტიმალური კონცენტრაციის დასადგენად და ზედმეტად ჯვარედინი კავშირის თავიდან აცილების მიზნით, ჩვენ პირველად გამოვყავით უჯრედები 5, 2.5 და 1 მმ DSS-ზე 5, 10, 5 და 30 წუთის განმავლობაში, შესაბამისად, და გავაანალიზეთ ლიზატები Coomassie-ით შეღებილი SDS-PAGE-ით. (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).უჯრედის ლიზატები, როგორც ჩანს, ძალიან ჯვარედინი კავშირშია ყველაზე დაბალ კონცენტრაციაზე და უმოკლეს დროში.ამიტომ, DSS ტიტრირებული იყო 1, 0.5 და 0.1 მმ-მდე 5 წუთის განმავლობაში (სურათი 1B).ოპტიმალური ჯვარედინი კავშირი დაფიქსირდა 0.5 მმ DSS-ით 5 წუთის განმავლობაში და ეს პირობები არჩეული იყო IFNα-თ დამუშავებული უჯრედებისთვის.გარდა ამისა, სურათი 1C გვიჩვენებს Western blot-ს, რომელიც შესრულებულია p53 (DO-1) ანტისხეულის გამოყენებით, რათა შეფასდეს ცილის ჯვარედინი კავშირის ხარისხი.
Flo-1 უჯრედები დამუშავდა 10 ნგ/მლ IFNα 24 საათის განმავლობაში კროსლინკერის დამატებამდე.ჯვარედინი დაკავშირებული უჯრედები შემდგომში განხორციელდა ორეტაპიანი პროტეოლიზის ლიზინგით და ცილები დამუშავდა FASP-ით (ნახ. 2)24,25.ჯვარედინი ტრიპტიური პეპტიდები გაანალიზდა მასის სპექტრომეტრიით (ნახ. 2).შემდეგ MS/MS სპექტრები ემთხვევა ცილის თანმიმდევრობას და რაოდენობრივად ფასდება MaxQuant26,27-ით.ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდები იდენტიფიცირებული იქნა მიღებული სპექტრებიდან SIM-XL პროგრამის გამოყენებით და ცალკეული ნაერთები გაერთიანდა რთულ ქსელში xQuest28 და SIM-XL29 ღია კოდის გამოთვლითი პროგრამული უზრუნველყოფის მილსადენების გამოყენებით (ნახ. 2).SIM-XL განსაზღვრავს ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედებას, შიდა ჯაჭვებს და ცალკეულ ჯაჭვებს მარტივ ან რთულ ცილის ნარევებში და უზრუნველყოფს სკრიპტებს ცილოვან სტრუქტურებში ურთიერთქმედების ვიზუალიზაციისთვის.გარდა ამისა, იგი ასახელებს თითოეულ ჯვარედინი მითითებას, როგორც ID ქულა MS/MS29 სპექტრის ხარისხის მიხედვით.იდენტიფიცირებულია რამდენიმე უაღრესად სანდო ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედება და კომპლექსი, ხოლო ურთიერთქმედებების ახალი ნაკრები შემდგომში იქნა გამოკვლეული კომპლექსების თანაიმუნოპრეციპიტაციისა და კონფორმაციული ცვლილებების გამოყენებით მოლეკულური დინამიკის (MD) მოდელირების გამოყენებით (ნახ. 2) 30, 31.
CLMS მეთოდის სქემატური მიმოხილვა.Flo-1 უჯრედები დამუშავდა 10 ნგ/მლ IFNα 24 საათის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა in situ ცილის ჯვარედინი კავშირი DSS-ის გამოყენებით, რასაც მოჰყვა უჯრედის ლიზი და ტრიფსინიზაცია.ჯვარედინი დაკავშირებული ნიმუშები გაანალიზდა Orbitrap-ის მასის სპექტრომეტრის გამოყენებით და შემდგომი ნიმუში იქნა აღებული პეპტიდის წინამორბედების ფრაგმენტაციისთვის LC-MS/MS-ის დროს.ორი დაკავშირებული პეპტიდი იდენტიფიცირებული იქნა მიღებული სპექტრებიდან ჯვარედინი პეპტიდების (SIM-XL) პროგრამის სპექტრის ამოცნობის აპარატის გამოყენებით და ყველა ნაერთი გაერთიანდა კომპლექსურ ქსელში გამოთვლითი მილსადენების გამოყენებით.გაფილტრეთ დაბალი ნდობის ურთიერთქმედებები ცრუ დადებითი მაჩვენებლის (FDR) ქულების საფუძველზე.რამდენიმე ახალი მაღალი სიზუსტის ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედება შემდგომში დადასტურდა ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციის გამოყენებით და კონფორმაციული ცვლილებები კომპლექსებში გამოკვლეული იყო მოლეკულური დინამიკის (MD) მოდელირების გამოყენებით.
სულ ~30,500 და ~ 28,500 პეპტიდი გამოვლინდა MaxQuant-ის გამოყენებით არასტიმულირებული და სტიმულირებული IFNα ნიმუშებში, შესაბამისად (დამატებითი ცხრილი S1, სურ. 3A).პეპტიდის სიგრძის განაწილებამ ორივე შემთხვევაში აჩვენა უფრო დიდი პეპტიდების უფრო მაღალი პროპორცია, რაც მიუთითებს ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდების არსებობაზე (ნახ. 3B,C).გარდა ამისა, უფრო დიდი პეპტიდების უფრო დიდი წილი იყო 40-55 დიაპაზონში IFNα დამუშავებულ ნიმუშებში (ნახ. 3C).log2 ინტენსივობის მიმართ პროტეინის რუქამ აჩვენა, რომ კლასიკური ინტერფერონის სტიმულირებული პროტეინები ყველაზე უხვი იყო არანამკურნალევ ნიმუშებთან შედარებით, მათ შორის MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 და HLA-F (სურათი 3D).ცილების გზების ანალიზმა სამჯერ მეტი გამდიდრებული IFNα მკურნალობის საპასუხოდ Reactome გზების მონაცემთა ბაზის გამოყენებით აჩვენა, რომ MHC-I შუამავლობით ანტიგენის პრეზენტაცია და დამუშავება იყო ყველაზე დომინანტური გზა (სურათი 3E).ადრინდელი მოხსენებების შესაბამისად, ანტივირუსული პასუხები შუამავლობით OAS და ISG15, ასევე IFNα/β და ციტოკინის სიგნალიზაცია იყო გააქტიურებულ გზებს შორის.გარდა ამისა, ლიზინის და სერინის სპეციფიური პროტეინის ჯვარედინი კავშირები იდენტიფიცირებული იყო თავდაპირველად შეძენილი MS/MS სპექტრებიდან SIM-XL-ის გამოყენებით.ბოლოდროინდელმა კვლევამ მოახსენა 104 ISG, რომლებიც მოიცავს 20 ვირუსს ვირუსის 9 კლასიდან, ISG გადაჭარბებული ექსპრესიის ცალკეული კვლევების მეტა-ანალიზით 5 უჯრედის ტიპზე9.თუმცა, დიდი მონაცემთა ნაკრების სკრინინგის გამოთვლითი შეზღუდვების დასაძლევად, ჩვენ დავიწყეთ უფრო მცირე მონაცემთა ნაკრებით, რათა შეგვესწავლა შესაძლო ურთიერთქმედებები IRDS გენების სიას შორის, რომლებიც მოხსენებულია პადარიას და სხვების მიერ, რომელთა უმეტესობა არის ISG.
დიფერენციალურად გამოხატული ჯვარედინი დაკავშირებული ცილების იდენტიფიკაცია IFNα-ზე საპასუხოდ (მონაცემები მიღებული MaxQuant-დან).(A) ვენის დიაგრამა, რომელიც წარმოადგენს საერთო და ექსკლუზიური პეპტიდების რაოდენობას, რომლებიც იდენტიფიცირებულია IFNα14 დამუშავებულ და არანამკურნალევ Flo-1 ნიმუშებში.პეპტიდის სიგრძის განაწილება დაუმუშავებელი (B) და IFNα დამუშავებული (C) ჯვარედინი ბმული ნიმუშების.(D) თერმული რუკა, რომელიც წარმოადგენს log2 (LFQ ინტენსივობას) დაუმუშავებელ და IFNα14 დამუშავებულ Flo-1 უჯრედებს შორის.მარცხენა პანელზე ნაჩვენებია ცილები, რომლებიც ყველაზე აქტიურად აქტიურდებიან IFNα-ს თანდასწრებით.(E) ჰისტოგრამა, რომელიც წარმოადგენს 20 ძირითადი გამდიდრების გზას IFNα მკურნალობის შემდეგ.Reactome ბილიკის მონაცემთა ბაზამ გააანალიზა ოთხჯერ მეტი ცვლილება IFNα-ზე პასუხისმგებელ პროტეინებში.
ინტერფერონის შუამავლობით ISG სტიმულაცია კარგად არის დადასტურებული, მაგრამ მოლეკულურ დონეზე ცუდად არის გაგებული, თუ როგორ აღწევს ეს ცილები ბიოლოგიური ფუნქციების ფართო სპექტრით.ჩვენ გამოვიკვლიეთ პროტეინის ურთიერთქმედება ცნობილ ISG-ებს შორის ნდობის მაღალი ხარისხით.საინტერესოა, რომ ჩვენ გამოვავლინეთ ქსელი, რომელშიც შედის MX1, USP18, ROBO1, OAS3 და STAT1 პროტეინები, რომლებიც ქმნიან დიდ კომპლექსს IFNα მკურნალობის საპასუხოდ (სურათი 4, ცხრილი S2) 32,33,34.რაც მთავარია, ეს ურთიერთქმედება იქნა ნაპოვნი IFNα-თ დამუშავებულ ყველა სამჯერ და არ იქნა ნაპოვნი დაუმუშავებელ ნიმუშებში, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ისინი ჩამოყალიბდა სპეციალურად IFNα მკურნალობის საპასუხოდ.ცნობილია, რომ STAT1 ტრანსკრიპციულად არეგულირებს ამ ISG-ების ექსპრესიას, მაგრამ მისი ურთიერთქმედება ISG-ებთან ცილის დონეზე არ არის შესწავლილი.STAT1-ის კრისტალურმა სტრუქტურამ აჩვენა, რომ მისი ხვეული დომენი (CCD) არ მონაწილეობს დნმ-თან ან პროტომერებთან ურთიერთქმედებაში დიმერების ფორმირებისას35.ეს α-სპირალი ქმნიან სპირალურ სპირალურ სტრუქტურას, რომელიც უზრუნველყოფს უპირატესად ჰიდროფილურ ზედაპირს ურთიერთქმედების წარმოქმნისთვის 35 .ჩვენს CLMS მონაცემებში, ჩვენ დავაკვირდით, რომ STAT1-თან ურთიერთქმედების უმეტესობა მოხდა SH2 დომენში, რომელიც წინ უძღვის CCD-ს, დამაკავშირებელ დომენს ან C-ტერმინალის კუდს (ნარჩენები 700-708) (სურათი 4A).წინა კვლევამ იტყობინება, რომ USP18 უკავშირდება STAT2-ის CCD და დნმ-შემაკავშირებელ დომენს (DBD) და რეკრუტირებულია I ტიპის ინტერფერონის რეცეპტორის IFNAR2 ქვეერთეულში, რათა შუამავლობდეს I ტიპის ინტერფერონის სიგნალიზაციის ინჰიბირებას 24 .ჩვენმა მონაცემებმა ასევე აჩვენა, რომ USP18 კატალიზური დომენი ურთიერთქმედებს STAT1 DBD-თან (სურათი 4A,D), რაც ვარაუდობს, რომ STAT1 და STAT2 შესაძლოა როლი შეასრულონ USP18-ის მოზიდვაში IFNAR2-ში.
პროტეინ-პროტეინის ISG ქსელი იდენტიფიცირებულია ჯვარედინი დაკავშირებულ უჯრედებში, რომლებიც მკურნალობენ IFNα.(A) 2D ურთიერთქმედების დიაგრამა, რომელიც გვიჩვენებს ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედებას (გენერირებული SIM-XL პროგრამაში), ხაზებით, რომლებიც წარმოადგენს ინტერმოლეკულურ ურთიერთქმედებებს (ჯვარედინი კავშირის წყვეტა დაყენებულია 3.5-ზე).სხვადასხვა იდენტობის დომენები მონიშნულია მათი ფერით32: MX1 დომენი, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) და GED (569–660).OAS3 დომენები: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) და OAS1_C (903-108).დომენი ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I–set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) და fn3 (777–864).STAT1 ველები: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) და STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) ჯვარედინი დაკავშირებული ცილების (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 და STAT1) წრიული მაყურებელი, ლურჯ და წითელ ფერებში მონიშნული ურთიერთქმედებებითა და ურთიერთქმედებებით.ჯვარედინი ბმულის ბარიერი დაწესდა 3.5-ზე.წერტილოვანი დიაგრამები მიუთითებს STAT1 ურთიერთქმედების ადგილებს MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) და OAS3 (F), ასევე K ან S ურთიერთქმედების ადგილებს ორ პეპტიდს შორის.ნახატზე, ჯვარედინი ბმულის ქულის ბარიერი დაყენებულია 3.0-ზე.(G) სხვადასხვა ურთიერთქმედების ადგილები STAT1 და OAS3 DI დომენებს შორის, რომლებიც გადანაწილებულია მათ ცილოვან სტრუქტურებზე PyMol-ში (PyMOL მოლეკულური გრაფიკული სისტემა, ვერსია 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) და OAS3 (pdb id: 4s3n34).) პროგრამა.
USP18-ის ორი იზოფორმა აღწერილია ადამიანებში, სრულმეტრაჟიანი ცილა, რომელიც უპირატესად მდებარეობს ბირთვში, და იზოფორმა N-ტერმინალური დომენის გარეშე, USP18-sf, რომელიც თანაბრად არის განაწილებული ციტოპლაზმასა და ბირთვში 36 .გარდა ამისა, ნავარაუდებია, რომ N-ბოლო არ არის სტრუქტურირებული და არ საჭიროებს იზოპეპტიდაზას აქტივობას ან ISG1537 შეკავშირებას.ჩვენს კვლევაში გამოვლენილი ურთიერთქმედებების უმეტესობა განლაგებული იყო ცილის N-ბოლოზე, რაც ვარაუდობს, რომ ეს ურთიერთქმედებები მოიცავს სრულმეტრაჟიან USP18-ს (სურათი 4A,D) და, შესაბამისად, სავარაუდოდ ხდება ბირთვში.უფრო მეტიც, ჩვენი მონაცემები ასევე მიუთითებს იმაზე, რომ N-ტერმინალი სპეციალიზირებულია ცილა-ცილის ურთიერთქმედებისთვის.IFNAR2-ის შეკავშირების ადგილი მდებარეობს 312-368 ნარჩენებს შორის და აღსანიშნავია, რომ კომპლექსის არცერთი ცილა არ უკავშირდება ამ რეგიონს (ნახ. 4A) 37,38.ეს მონაცემები ერთად აღებული მიუთითებს, რომ IFNAR2 შემაკავშირებელ დომენი გამოიყენება ექსკლუზიურად რეცეპტორების პროტეინის მიერ.გარდა ამისა, მხოლოდ OAS3 და ROBO1 აღმოჩნდა დაკავშირებული დომენებთან N-ბოლო და IFNAR2 შემაკავშირებელი ადგილის ზემოთ (სურათი 4A).
ROBO1 მიეკუთვნება ტრანსმემბრანული სასიგნალო მოლეკულების იმუნოგლობულინების (Ig) ზეოჯახს და შედგება ხუთი Ig დომენისაგან და სამი ფიბრონექტინის (Fn) დომენისაგან უჯრედგარე რეგიონში.ამ უჯრედგარე დომენებს მოჰყვება მემბრანულ-პროქსიმალური რეგიონი და ერთი ტრანსმემბრანული სპირალი 39. არასტრუქტურირებული უჯრედშიდა რეგიონი მდებარეობს C-ბოლოზე და შეიცავს კონსერვირებული თანმიმდევრობის მოტივებს, რომლებიც შუამავლობენ ეფექტურ ცილებთან შეკავშირებას39.რეგიონი, რომელიც ვრცელდება ამინომჟავებიდან ~1100-დან 1600-მდე, უმეტესად მოუწესრიგებელია.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ MX1 ურთიერთქმედებს ROBO1-თან Ig, Fn და უჯრედშიდა დომენების მეშვეობით, ხოლო STAT1-თან ურთიერთქმედების უმეტესობა ხდება მის CCD-ს, დამაკავშირებელ დომენსა და ROBO1-ის C-ტერმინალს შორის (ნახ. 4A,E).მეორე მხრივ, DI, DIII და OAS3 დამაკავშირებელ რეგიონებთან ურთიერთქმედება განაწილდა ROBO1 პროტეინზე (ნახ. 4A).
ოლიგოადენილატ სინთაზას (OAS) პროტეინის ოჯახი იღებს და აკავშირებს უჯრედშიდა ორჯაჭვიან რნმ-ს (dsRNA), განიცდის კონფორმაციულ ცვლილებებს და სინთეზირებს 2',5'-თან დაკავშირებულ ოლიგოადენილატებს (2-5 As)40.დადგინდა, რომ სამ OAS-ს შორის, OAS3 ავლენს ყველაზე მაღალ აფინურობას dsRNA-ს მიმართ და ასინთეზებს ყველაზე ნაკლებ რაოდენობას 2-5 As-ს, რომელსაც შეუძლია გაააქტიუროს RNase L და ამით შეზღუდოს ვირუსის რეპლიკაცია 41 .OAS ოჯახი შედგება პოლიმერაზა ბეტა (pol-β) მსგავსი ნუკლეოტიდის ტრანსფერაზას დომენებისგან.წინა კვლევამ აჩვენა, რომ C-ტერმინალური დომენის (DIII) კატალიზური აქტივობა დამოკიდებულია dsRNA-შემაკავშირებელ დომენზე (DI), რომელიც საჭიროა OAS342-ის გააქტიურებისთვის.ჩვენ დავაკვირდით, რომ OAS3-ის DI და DII დომენები ურთიერთქმედებენ CCD-თან და მცირე შეერთების რეგიონთან SH2-სა და STAT1 TAD-ს შორის (სურათი 4A,F).ცილის სტრუქტურაზე სხვადასხვა ჯვარედინი კავშირის ადგილების გადაფარვამ გამოავლინა ურთიერთქმედება β-ფურცელსა და DBD STAT1 მარყუჟსა და ღია ჯიბეს ან ღრუს შორის, რომელიც წარმოიქმნება ნარჩენებით 60-75 OAS3-ის DI დომენში (ნახ. 4G).კომპლექსში ცილების ორიენტაციამ ასევე მიუთითა, რომ OAS3-თან არცერთი ურთიერთქმედება არ ერევა მისი DI დომენის დნმ-ის შეკავშირების უნარში (ნახ. S1A).გარდა ამისა, GTPase MX1-ის N-ტერმინალური დომენი ინტენსიურად ურთიერთქმედებს OAS3-ის DI და DIII დომენებთან (ნახ. 4A).ჩვენ ასევე დავაკვირდით OAS1-სა და MX1-ს შორის ურთიერთქმედებას IFNα-თ დამუშავებულ სამივე გამეორებაში, სადაც ერთი OAS1 დომენი (ასევე კატალიზურად აქტიური) ურთიერთქმედებს სამივე MX1 დომენთან (სურათი S2A,B).
MX პროტეინები არის დინეინის მსგავსი GTP-აზების დიდი ოჯახის ნაწილი, რომელიც შეიცავს N-ტერმინალურ GTPase დომენს, რომელიც აკავშირებს და ჰიდროლიზებს GTP-ს, შუალედურ დომენს, რომელიც შუამავლობს თვითშეკრებას და C-ტერმინალური ლეიცინის ელვა, რომელიც მოქმედებს როგორც GTPase (LZ ).დომენის ეფექტორის დომენი25,43.MX1 აკავშირებს ვირუსული პოლიმერაზების ქვედანაყოფებს ვირუსული გენის ტრანსკრიფციის დაბლოკვის მიზნით43.ადრე მოხსენებულმა საფუარის ორ ჰიბრიდულმა ეკრანმა აჩვენა, რომ PIAS1-თან ასოცირებული MX1 აინჰიბირებს STAT1 შუამავლობით განპირობებულ გენის აქტივაციას დნმ-ის დამაკავშირებელი აქტივობის დაბლოკვით და ასევე აქვს SUMO E344,45 ლიგაზას აქტივობა.აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ MX1 აკავშირებს STAT1-ს (სურათი 4C,D), თუმცა, როგორ მოქმედებს ეს ურთიერთქმედება STAT1-ის შუამავლობით გენის აქტივაციაზე IFNα-ზე საპასუხოდ, საჭიროებს შემდგომ კვლევას.გარდა ამისა, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ MX1 ურთიერთქმედებს IFIT3-თან და DDX60-თან სამივე IFNα დამუშავებული გამეორებით (ნახ. S2C).
DDX60 არის IFN-ი ინდუცირებული ციტოპლაზმური ჰელიკაზა, რომელიც ადრე იყო მოხსენებული, რომ თამაშობდა როლს ვირუსული რნმ46-ის RIG-I-დან დამოუკიდებელ დეგრადაციაში.ის ურთიერთქმედებს RIG-I-თან და ააქტიურებს მის სიგნალიზაციას ლიგანდის სპეციფიკური წესით 46. DDX60 შედგება DEXD/H-Box ჰელიკაზას დომენისგან და C-ტერმინალური ჰელიკაზის დომენისგან, რომელიც აკავშირებს ვირუსულ რნმ-ს და დნმ47-ს.მისი ურთიერთქმედების უმეტესობა MX1-თან და IFIT3-თან ხდება გრძელ N- და C-ტერმინალურ რეგიონებში კანონიკური დომენების ან მოტივების გარეშე (ნახ. S2E,F).თუმცა, MX1 ასევე ასოცირდება DEXD/H-Box ჰელიკაზის დომენთან (ნახ. S2E).IFIT ოჯახის პროტეინებს აქვთ გამორჩეული სპირალი-ბრუნი-სპირალი მოტივის ტანდემი ასლები, რომელსაც ეწოდება ტეტრაპეპტიდის გამეორება (TPR).აღმოჩნდა, რომ IFIT3 იყო RIG-I სიგნალიზაციის დადებითი მოდულატორი და, შესაბამისად, MAVS კომპლექსის კომპონენტი.ერთად აღებული, ჩვენი მონაცემები ვარაუდობს, რომ IFIT3 და DDX60 ურთიერთქმედებენ ძირითადად რეგიონში IFIT3-ის TPR 3-6-ს შორის და შეიძლება შეასრულონ როლი RIG-I/MAVS სიგნალიზაციაში (ნახ. S2F).
იმის გათვალისწინებით, რომ მთელი პროტეომის სკრინინგი არის გამოთვლითი ინტენსიური, ჩვენ შემდეგ შევამოწმეთ მთელი ადამიანის UniProt მონაცემთა ბაზა IFNα-თ დამუშავებული ერთ-ერთი გამეორების არსებობისთვის.ამ რეპლიკაში აღმოვაჩინეთ რამდენიმე უაღრესად საიმედო ურთიერთქმედების ქსელი HLA-A-სთვის.MS/MS სპექტრით გამოვლენილი ცილის გზების ანალიზმა აჩვენა, რომ MHC-I-ზე დაფუძნებული ანტიგენის დამუშავება და პრეზენტაცია არის მთავარი გზა, რომელიც გამოწვეულია ინტერფერონით (ნახ. 3D).ამიტომ, ჩვენ ფოკუსირებული ვიყავით MHC-I მოლეკულების ცილოვანი ურთიერთქმედების შესწავლაზე ნდობის მაღალი ხარისხით ყველა ჯვარედინი დაკავშირებულ ნიმუშში.HLA შედგება α1, α2 და α3 დომენებისა და მსუბუქი ჯაჭვებისგან, ხოლო მიკროგლობულინი β2 (β2მ) არის მუდმივი ცილა 49.ენდოპლაზმურ რეტიკულუმში აწყობის შემდეგ, HLA არასტაბილურია პეპტიდური ლიგანდების არარსებობის შემთხვევაში50.პეპტიდთან დამაკავშირებელი ღარი იქმნება უაღრესად პოლიმორფული და არასტრუქტურირებული α1 და α2 დომენებით არაპეპტიდური ფორმით და შედარებით ნაკლებად პოლიმორფული α351 დომენით.IFNα-ს თანდასწრებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ორი HLA-A კომპლექსი: ერთი ურთიერთქმედებს HMGA1-თან და H2B-თან (სურათი 5, ცხრილი S3) და მეორე ურთიერთქმედებს MDN1, LRCH4 და H2B-თან (სურათი 6).
IFNα იწვევს HLA-A ურთიერთქმედების ქსელს H2B (H2BFS) და HMGA1-თან.(A) 2D დიაგრამა (გენერირებული SIM-XL პროგრამული უზრუნველყოფაში), რომელიც ასახავს სხვადასხვა ტიპის ურთიერთქმედებას H2B-HLA-A-HMGA1 კომპლექსში: ურთიერთდაკავშირება (ლურჯი), ურთიერთდაკავშირება (წითელი) და ერთი ბმული (შავი)..სხვადასხვა იდენტობის დომენები ფერადი კოდირებულია32: H2B (ჰისტონი; 2–102) და MHC-I (MHC_1; 25–203, ჯგუფი C1; 210–290 და MHC_I_C; 337–364).ჯვარედინი ბმულის ბარიერი დაწესდა 3.5-ზე.წერტილოვანი ნახაზები მიუთითებს HLA-A ურთიერთქმედების ადგილებს H2B (B) და HMGA1 (C), ისევე როგორც K ან S ურთიერთქმედების ადგილებს ორ პეპტიდს შორის.ნახატზე, ჯვარედინი ბმულის ქულის ბარიერი დაყენებულია 3.0-ზე.(D) პროტეინებს შორის ურთიერთობა, რომლებიც ნაჩვენებია PyMOL პროგრამაში H2B, HLA-A და HMGA1 ცილების სტრუქტურებში.ეს სტრუქტურები მოდელირებული იყო Phyre2 სერვერის გამოყენებით (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) და H2B, HLA-A და HMGA1 პროტეინებისთვის შაბლონური სტრუქტურები იყო 1kx552, 1kj349 და 2eze55, შესაბამისად.
IFNα იწვევს HLA-A ურთიერთქმედების ქსელს H2B (H2BFS), MDN1 და LRCH4-თან.(A) ინტრამოლეკულური (წითელი) და ინტერმოლეკულური (ლურჯი) ჯვარედინი ბმულები წარმოდგენილი 2D ინტერაქტიულ რუკაზე (გენერირებული SIM-XL პროგრამული უზრუნველყოფაში) MDN1 წარმოდგენილია წრეში.ჯვარედინი ბმულის ბარიერი დაწესდა 3.5-ზე.სხვადასხვა იდენტობის დომენები ფერად კოდირებულია32: H2B (ჰისტონი; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ჯგუფი C1; 210–290 და MHC_I_C; 337–364) და LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) და CH (535-641)).(B) კავშირი პროტეინებს შორის, რომლებიც ნაჩვენებია PyMOL პროგრამაში H2B, HLA-A, LRCH4 და MDN1 ცილების სტრუქტურებში.ეს სტრუქტურები მოდელირებულია Phyre2 სერვერის გამოყენებით (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) შაბლონური სტრუქტურებით 1kx552, 1kj349, 6hlu62 და 6i2665 H2B, HLA-A, LRCH4 და MDN1 პროტეინებისთვის, შესაბამისად.წერტილოვანი დიაგრამები აჩვენებს K ან S ურთიერთქმედების ადგილებს HLA-A-სთვის H2B (C), LRCH4 (D) და MDN1 (E).ნაკვეთებისთვის, ჯვარედინი ბმულის ქულის ბარიერი დაყენდა 3.0-ზე.
გენომის მთლიანობის შენარჩუნების გარდა, ჰისტონი H2B ასევე მონაწილეობს ტრანსკრიფციის რეგულირებაში.H2B ცილა შედგება ცენტრალური ჰისტონური დომენისგან (HFD), რომელიც წარმოიქმნება სამი α-სპირალისაგან, რომლებიც გამოყოფილია მარყუჟებით და C-ტერმინალური კუდით 41,52.H2B-თან ურთიერთქმედების უმეტესი ნაწილი ხდება α1 სპირალში, რომელიც უზრუნველყოფს ტრიმერიზაციას HFD ჰეტეროდიმერთან (ნახ. 5A,B).მიუხედავად იმისა, რომ ლიზინი მონაწილეობს დნმ-ის შეკავშირებაში, ზოგიერთი ლიზინი ასევე არის აცეტილირების ან მეთილაციის ალტერნატიული ადგილები.მაგალითად, ნარჩენები K43, K46 და K57 H2B-დან არ მონაწილეობენ დნმ-ის პირდაპირ შეკავშირებაში, მაგრამ არიან სხვადასხვა პოსტტრანსკრიპციული მოდიფიკაციების სამიზნეები53.ანალოგიურად, ნარჩენებმა K44, K47 და K57 H2B-ში შეიძლება შეასრულონ ალტერნატიული როლი IFNα-ს არსებობისას, მათ შორის სხვა ცილებთან ურთიერთქმედების ჩათვლით (ნახ. 5A, B).გარდა ამისა, ექსტრაქრომოსომული ჰისტონი H2B ააქტიურებს იმუნურ პასუხს სხვადასხვა ტიპის უჯრედებში, მოქმედებს როგორც ციტოზოლური სენსორი ინფექციური აგენტებიდან ან დაზიანებული უჯრედებიდან მიღებული ორჯაჭვიანი დნმ-ის (dsDNA) ფრაგმენტების აღმოსაჩენად54.დნმ ვირუსების თანდასწრებით, H2B დაქვეითება აფერხებდა IFN-β წარმოებას და STAT154 ფოსფორილირებას.ცნობილია, რომ H2B ასევე მოძრაობს ბირთვში უფრო სწრაფად, ვიდრე სხვა ძირითადი ჰისტონები54.H2B ურთიერთქმედება MDN1-თან და LRCH4-თან ასევე დაფიქსირდა შერჩეულ დაუმუშავებელ ნიმუშებში.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ HLA-A ურთიერთქმედებს H2B-თან სამივე IFNα დამუშავებულ ნიმუშში და ერთ დაუმუშავებელ განმეორებით ნიმუშში.ეს მონაცემები ასახავს H2B-ის როლს ალტერნატიულ ფიზიოლოგიურ ფუნქციაში, ტრანსკრიპციული რეგულირებისგან დამოუკიდებლად.
HMGA1 (მაღალი მობილურობის ჯგუფი AT-Hook 1), პატარა ნუკლეოპროტეინი, მდიდარია დაავადების ხელშემწყობი ამინომჟავებით, იდენტიფიცირებულია HLA-A-სთან ერთად.მას აქვს მჟავე C-ტერმინალური კუდი და სამი განსხვავებული DBD, რომელსაც ეწოდება AT კაკვები, რადგან ისინი უკავშირდებიან AT-ით მდიდარი რეგიონის მცირე ღარს dsDNA55,56-ში.ეს შეკავშირება იწვევს დნმ-ის მოხრას ან გასწორებას, რაც საშუალებას აძლევს კანონიკურ ტრანსკრიფციის ფაქტორებს წვდომის მის კონსენსუს თანმიმდევრობას.ითვლება, რომ C-ტერმინალური კუდი ჩართულია ცილა-ცილის ურთიერთქმედებებში და ტრანსკრიფციის ფაქტორების რეკრუტირებაში, ვინაიდან C-ტერმინალის წაშლის მუტანტები ვერ ახერხებენ ტრანსკრიფციის დაწყებას57.უფრო მეტიც, ეს დომენი შეიცავს რამდენიმე კონსერვაციულ ფოსფორილირების ადგილს, რომლებიც ცნობილია კინაზების სუბსტრატები 58 .ჩვენ დავაკვირდით HLA-A და H2B ურთიერთქმედებას HMGA1-თან C-ტერმინალური დომენის მიღმა, რაც ვარაუდობს, რომ C-ტერმინალური დომენი ძირითადად გამოიყენება ტრანსკრიფციის ფაქტორის დასაკავშირებლად (ნახ. 5A, C).HMGA პროტეინები კონკურენციას უწევს ჰისტონ H1-ს ადაპტერ დნმ-თან შეკავშირებისთვის, რითაც ზრდის ხელმისაწვდომობას57.ანალოგიურად, როგორც ჩანს, სავარაუდოა, რომ HMGA ურთიერთქმედებს ჰისტონთან H2B-თან დამაკავშირებელი დნმ-ის გასწვრივ ჰისტონ H1-თან კონკურენციაში.HMGB1 იწვევს HLA-A, -B და -C-ის ექსპრესიას დენდრიტულ უჯრედებში, რაც იწვევს მათ გააქტიურებას59, მაგრამ HMG-სა და HLA-ს შორის ურთიერთქმედება ადრე არ იყო მოხსენებული.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ HMGA1 ურთიერთქმედებს HLA-A-ს α1 და α3 დომენებთან, უმეტესი ურთიერთქმედებით მისი 3 DBD-ის გარეთ (სურათი 5A,C).ჩვენს ხელში აღმოჩნდა, რომ HLA-A ლოკალიზებულია ბირთვში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები) და იმის გათვალისწინებით, რომ H2B და HMGA1 ასევე არიან ბირთვში, ეს ურთიერთქმედება სავარაუდოდ ბირთვში ხდება.H2B, HLA-A და HMGA1-ს შორის გაზომილი სპეციფიკური დანამატები ნაჩვენებია სურათზე 5D.
HLA-A-ს სხვა ცილებთან ურთიერთქმედების უმეტესობა ხდება მის α1 და α2 დომენებში და მოუწესრიგებელ C-ტერმინალურ დომენში (ნახ. 6).ერთ-ერთ ამ მაგალითში ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ HLA-A ურთიერთქმედებს LRCH4-ის მოუწესრიგებელ N-ტერმინალურ კუდთან (სურათი 6A,D).LRCH4 არეგულირებს TLR4 აქტივაციას და LPS ციტოკინის ინდუქციას, რითაც ახდენს თანდაყოლილი იმუნური პასუხის მოდულირებას60,61.ეს არის მემბრანული ცილა ლეიცინით მდიდარი ცხრა გამეორებით (LRRs) და კალმოდულინის (CH) ჰომოლოგიური მოტივით მის ექტოდომინში, რასაც მოჰყვება ტრანსმემბრანული დომენი (TMD) 60, 62.ცნობილია, რომ CH დომენები შუამავლობენ ცილა-ცილის ურთიერთქმედებას 60 .დაახლოებით 300 ამინომჟავის მონაკვეთი LRR და CH დომენებს შორის შედარებით ხელმისაწვდომი, მაგრამ მოუწესრიგებელია.უწესრიგო რეგიონების, როგორც ცილოვან-ცილოვანი ქსელების და ვეზიკულური ტრანსპორტის შუამავლების ფუნქციის საფუძველზე 63, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ცილოვანი ურთიერთქმედების უმეტესობა ხდება მოუწესრიგებელ რეგიონებში.MDN1-თან ურთიერთქმედება განაწილებული იყო ცილის მთელ სიგრძეზე, მათ შორის LRR1, LRR6, CH დომენები და შემთხვევითი რეგიონები, ხოლო H2B ძირითადად დაკავშირებული იყო CH დომენთან (ნახ. 6A, B).აღსანიშნავია, რომ არცერთი ურთიერთქმედება არ მოიცავდა TMJ-ს, რაც მიუთითებს CLMS მიდგომის სპეციფიკაზე (სურათი 6A, B).
MDN1 ასევე იდენტიფიცირებულია, როგორც HLA-A ცილის ქსელის ნაწილი (სურათი 6A).ის მიეკუთვნება AAA ცილების ოჯახს (ATPases, რომლებიც დაკავშირებულია სხვადასხვა აქტივობასთან).ეს არის იგივე N-ტერმინალური AAA დომენი, რომელიც ორგანიზებულია ჰექსამერულ რგოლში და შლის შეკრების ფაქტორს 60S 64 რიბოსომური ქვედანაყოფიდან.როგორც ჩანს, dynein64,65,66 მსგავსია.გარდა ამისა, Asp/Glu მდიდარ რეგიონს მოსდევს MIDAS დომენი (ლითონის იონზე დამოკიდებული ადგილი).MDN1-ის დიდი ზომის (დაახლოებით 5600 ამინომჟავა) და მისი შეზღუდული ჰომოლოგიის გამო კარგად შესწავლილ ცილებთან, ცოტა რამ არის ცნობილი მისი სტრუქტურისა და ფუნქციის შესახებ ადამიანებში.ჩვენ დავადგინეთ HLA-A, H2B და LRCH4, როგორც MDN1 შემაკავშირებელ პარტნიორებს და გამოვავლინეთ მათი ორიენტაცია, როგორც ცილოვანი კომპლექსები PyMol-ში (ნახ. 6A,B).ეს სამი ცილა ურთიერთქმედებს AAA დომენთან, დინეინის მსგავს დამაკავშირებელ დომენთან და შესაძლოა MIDAS MDN1 დომენთან.წინა ანგარიშში, სატყუარას პროტეინების აფინურობით გაწმენდისას MDN1 იდენტიფიცირებული იყო, როგორც ცილა, რომელიც დაკავშირებულია ჰისტონთან H2B67.გარდა ამისა, უახლესმა კვლევამ ასევე მოახსენა ურთიერთქმედება MDN-სა და HLA-B-ს შორის HCT116 უჯრედებში აფინურობით გაწმენდილი მასის სპექტრომეტრიის გამოყენებით, რაც მხარს უჭერს ჩვენს დასკვნებს68.ამ კომპლექსის იდენტიფიკაცია IFNα დამუშავებულ ნიმუშებში მიუთითებს MDN1-ის როლზე ინტერფერონის სიგნალიზაციაში.
იმის გამო, რომ HLA გენები ძლიერ პოლიმორფულია, ჩვენ გამოვყავით სექვენირების წაკითხვები, რომლებიც ასახავს HLA-A, -B და -C, Flo-1 უჯრედების რნმ თანმიმდევრობის მონაცემებიდან (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).პეპტიდური თანმიმდევრობა, რომელიც შეესაბამება თანმიმდევრობის კითხვას, გამოავლინა მნიშვნელოვანი განსხვავებები HLA-A, -B და -C შორის რეგიონებში, სადაც ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდები იყო განთავსებული HLA-A-ში (სურათი S3).გარდა ამისა, ჩვენ არ დაგვიფიქსირებია HLA-B/C მოლეკულების ცილა-ცილა ჯვარედინი კავშირი H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ცილებთან.ეს ვარაუდობს, რომ HLA-A, MDN1, LRCH1 და HMGA1 შორის ნაპოვნი ცილოვანი ურთიერთქმედება არის HLA-A სპეციფიკური.გარდა ამისა, არაჯვარედინი ნიმუშების პროტეომიურმა ანალიზმა (ცხრილი S4) აჩვენა, რომ HLA-A-ს აქვს უფრო მაღალი თანმიმდევრობის დაფარვა HLA-B ან HLA-C-თან შედარებით.HLA-A-სთვის გამოვლენილი პეპტიდები მაღალი ინტენსივობით იყო როგორც IFNα-დამუშავებულ, ასევე არანამკურნალევ ნიმუშებში.
იმის უზრუნველსაყოფად, რომ აქ იდენტიფიცირებული ურთიერთქმედება არ იყო ორი ცილის არასპეციფიკური ჯვარედინი კავშირის გამო, ჩვენ კიდევ დავადასტურეთ ორი ახალი HLA-A ურთიერთქმედების ფაქტორი თანაიმუნოპრეციპიტაციური ანალიზის შესრულებით.HLA-A ურთიერთქმედება ენდოგენურ MDN1-თან და H2B-თან გამოვლინდა როგორც IFNα-დამუშავებულ, ასევე არანამკურნალევ Flo-1 უჯრედებში (სურათი 7, სურათი S4).ჩვენ დავადასტურეთ, რომ HLA-A დაფიქსირდა H2B-ით იმუნოპრეციპიტატებში და რომ ეს კავშირი განპირობებული იყო IFNα მკურნალობით, ვინაიდან HLA-A არ იყო დაუმუშავებელი უჯრედების იმუნოპრეციპიტატის ნიმუშებში (სურათი 7A).თუმცა, ჩვენი მონაცემები ვარაუდობს, რომ IFNα დიფერენციალურად არეგულირებს HLA-A კავშირს H2B და MDN1-თან.IFNα იწვევს კავშირს H2B-სა და HLA-A-ს შორის, მაგრამ ამცირებს მის კავშირს MDN1-თან.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ MDN1 ასოცირებული იყო HLA-A-სთან კონტროლებში და IFNα-ს დამატებამ შეამცირა ეს ურთიერთქმედება IFNα-ს მიერ MDN1 ინდუქციისგან დამოუკიდებლად (სურათი 7B,C).გარდა ამისა, HLA-A იმუნოპრეციპიტაციამ დააფიქსირა H2B A549 უჯრედებში (ნახ. S4), რაც ვარაუდობს, რომ ეს ურთიერთქმედება დამოუკიდებელია უჯრედის ტიპისგან.ერთად აღებული, ეს შედეგები მხარს უჭერს ინტერფერონის შუამავლობით HLA-A-ს H2B-თან და MDN1-თან ურთიერთქმედებას.
HLA-A ასუფთავებს H2B და MDN1.წარმომადგენლობითი ენდოგენური H2B (A) და MDN1 (B) იმუნობლოტები იყო იმუნოპრეციპიტაცია IFNα დამუშავებული Flo-1 უჯრედებიდან და გამოიკვლიეს მითითებულ ანტისხეულებზე.თაგვისა და კურდღლის IgG გამოიყენებოდა როგორც უარყოფითი კონტროლი.(C) სხვადასხვა ანტიგენების შედარებითი რაოდენობა (შეყვანა) გამოსახულია იმუნობლოტებით, რომლებიც გამოკვლეულია მითითებული ანტისხეულების წინააღმდეგ, β-აქტინი გამოიყენებოდა როგორც დატვირთვის კონტროლი.
გამოკვლეული იყო ინტერფერონით გამოწვეული ერთ-ერთი უაღრესად საიმედო ჯვარედინი დაკავშირებული ქსელის, H2B-HLA-A-HMGA1-ის სტრუქტურული თვისებები.ჩვენ გამოვიყენეთ მოლეკულური დინამიკის მოდელირება, როგორც ალტერნატიული მიდგომა ამ კომპლექსში ჩართული ცილების კონფორმაციული დინამიკის გასაგებად (სურათი 8).CLMS მონაცემებიდან მიღებული დასკვნები გვთავაზობს H2B, HLA-A და HMGA1 ცილების სხვადასხვა კონფორმაციის შესაძლებლობას.ამიტომ, გამხსნელ გარემოში მოდელირებული იქნა შემდეგი პოტენციური კომპლექსები: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A და H2B-HLA-A-HMGA1.ცილა-პროტეინის დამაგრების საწყისი ეკრანი MOE-ის (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., მონრეალი, კვებეკი, კანადა) პაკეტის გამოყენებით ვარაუდობდა შესაძლო კონფორმაციებს, რომლებიც განსხვავდება ამ პროტეინებს შორის (ნახ. 8A).დოკ პროტეინის კომპლექსის ვიზუალიზაციამ გამოავლინა რამდენიმე ურთიერთქმედება და შესაძლო კონფორმაციები (სურათი 5A, 8).ამგვარად, ერთი შესაძლო კონფორმაცია ნაჩვენებია სურათზე 8A (მონიშნული ჯვარედინი ბმულებით) და შემდგომ შეფასდა MD მოდელირების მილსადენის გამოყენებით.გარდა ამისა, H2B-ის ან HMGA1-ის დაკავშირება HLA-A-სთან ხაზს უსვამს H2B-ის მაღალ აფინურობას HLA-A-სთან (ნახ. 8A).
შესაძლო ქსელების კონფორმაციული დინამიკა H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A და H2B-HLA-A-HMGA1 კომპლექსებს შორის.(A) მარცხენა პანელი არის 2D რუკა (გენერირებული SIM-XL პროგრამული უზრუნველყოფაში) ინტრამოლეკულური (წითელი) და ინტერმოლეკულური (ლურჯი) ჯვარედინი ბმულების (ჯვარედინი რგოლის წყვეტა დაყენებულია 3.5-ზე).გარდა ამისა, იდენტიფიცირებული ჯვარედინი დამაკავშირებელი ნარჩენები ეტიკეტირებულია H2B, HLA-A და HMGA1 ცილების სტრუქტურებზე.ამ ცილების ასოცირებული კონფორმაციები მოპოვებული იქნა MOE პაკეტში განხორციელებული დოკ მილსადენის გამოყენებით.ქვედა მარცხენა პანელი გვიჩვენებს H2B-HLA-A და HMGA1-HLA-A კომპლექსების სხვადასხვა შესაძლო კონფორმაციებს ცილა-პროტეინის შეკავშირების სხვადასხვა აფინურობით (GBVI/WSA dG; კკალ/მოლი).(B) ატომური პოზიციების სტანდარტული გადახრა (RMSD) (წყალბადის ატომების გამოკლებით) თითოეული ცილის სტრუქტურისთვის.(C) ცილა-პროტეინის წყალბადის ბმის ინტერმოლეკულური ურთიერთქმედება სხვადასხვა სიმულირებული კომპლექსებიდან, ≥ 10 ns ხანგრძლივობის სპეციფიკური ურთიერთქმედების გათვალისწინებით.h-ბმის დონორი-მიმღების ათვლის მანძილი დაყენებული იყო 3,5 Å-ზე, ხოლო დონორი-H-მიმღების წყვეტის კუთხე დაყენებული იყო ≥ 160°-180°-ზე.(D) ეტიკეტირებული ნარჩენები, რომლებიც ქმნიან HLA-A ცილა-ცილის ურთიერთქმედებას მათ შესაბამის პარტნიორებთან, ≥ 20 ns-ზე, მოპოვებული HLA-A-H2B და HLA-A-HMGA1 კომპლექსებიდან.ცილის სტრუქტურები წარმოადგენს საშუალო სტრუქტურას 100 ns MDS.(E) ურთიერთქმედება HLA-A-H2B და HLA-A-HMGA1 კომპლექსებს შორის H2B-HLA სიმულაციის მიერ 100 ns-ზე მეტი ხნის განმავლობაში თვალყურის დევნებული ურთიერთქმედებებთან შედარებით K ან S ურთიერთქმედების ადგილზე ორ პეპტიდს შორის.კომპლექსები /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ჯვარედინი ბმულების შეფასების ზღვრული მნიშვნელობა დაყენებული იყო 3.0-ზე და მხედველობაში იქნა მიღებული MDS-ის სპეციფიკური ურთიერთქმედება ≥ 10 ns.ცილის სტრუქტურების ვიზუალიზაცია მოხდა BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) და Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) პაკეტების გამოყენებით.
HLA-A მოლეკულების სტაბილურობა დროთა განმავლობაში (სტანდარტული გადახრა; RMSD ან სტანდარტული გადახრა; RMSF) მიუთითებს, რომ H2B ან HMGA1 ცილების არსებობა კომპლექსებში HLA-A-ს სტაბილიზაციას ახდენს (სურათი 8B, სურათი S5).HMGA1 ცილა მჭიდროდ უკავშირდება HLA-A-ს B2M ადგილს, რაც იწვევს HLA-A ამინომჟავების სტაბილურობას HLA-A-HMGA1 ან H2B-HLA-A-HMGA1 კომპლექსში (სურათი 8B, სურათი S5).კერძოდ, HLA ნარჩენები ~60-90 და ~180-210 აღმოჩნდა ნაკლებად მოქნილი H2B-ის თანდასწრებით (სურათი 8B).H2B და HMGA1 აჩვენეს უკეთესი კავშირი HLA-A-სთან H2B-HLA-A-HMGA1 კომპლექსში, ვიდრე HLA-A აკავშირებს H2B ან HMGA1 მარტო (სურათი 8C,D; ცხრილი S5).წყალბადის კავშირში ჩართული ნარჩენები (MD მოდელირებული მაღალი დაკავება ≥ 10 ns) ემთხვევა CLMS ურთიერთქმედების ადგილებს (K ან S ნარჩენები) კომპლექსში, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ CLMS-ის მიერ გამოვლენილი ურთიერთქმედება ძალიან სანდოა.საიმედოობა (ნახ. 8E).CLMS და MD მოდელირებაში HLA-A ნარჩენები დაახლოებით 190-210 და დაახლოებით 200-220 ამინომჟავას შორის აღმოჩნდა, რომ აკავშირებს H2B და HMGA1, შესაბამისად (სურათი 8E).
ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედება ქმნის დინამიურ სტრუქტურულ ქსელებს, რომლებიც შუამავლობენ უჯრედშიდა კომუნიკაციას გარკვეული სტიმულის საპასუხოდ.იმის გამო, რომ პროტეომიკის მრავალი მიდგომა აღმოაჩენს ცვლილებებს ცილის საერთო სტაბილურ დონეზე, ცილა-ცილის ურთიერთქმედების დინამიკა მოითხოვს დამატებით ინსტრუმენტებს დამაკავშირებელი ინტერფეისების დასაფიქსირებლად და CLMS არის ერთ-ერთი ასეთი ინსტრუმენტი.ინტერფერონის სასიგნალო სისტემა არის ციტოკინური ქსელი, რომელიც საშუალებას აძლევს უჯრედებს რეაგირება მოახდინონ გარემოსდაცვით პათოგენურ და შინაგან პათოლოგიურ სიგნალებზე, რაც მთავრდება ინტერფერონის ინდუქციური ცილების ქვეჯგუფების ინდუქციით.ჩვენ გამოვიყენეთ CLMS, რათა დაგვედგინა, შეიძლებოდა თუ არა ახალი ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედების იდენტიფიცირება ინტერფერონით გამოწვეულ პროტეინებს შორის.გლობალური პროტეინის ჯვარედინი კავშირის ანალიზი ინტერფერონზე პასუხისმგებელი Flo-1 უჯრედის მოდელში გამოყენებული იყო ცილის კომპლექსების დასაფიქსირებლად.ტრიპტიური პეპტიდების ექსტრაქცია არაჯვარედინ-დაკავშირებული და ჯვარედინი დაკავშირებული უჯრედებიდან იძლევა პეპტიდების დათვლას, გზის გამდიდრებას და პეპტიდის სიგრძის განაწილებას განსაზღვრული LFQ ინტენსივობით.კანონიკური ინტერფერონის ინდუცირებადი პროტეინები იდენტიფიცირებული იყო, როგორც დადებითი შიდა კონტროლი, ხოლო დაფიქსირდა კანონიკური ინტერფერონის ინდუცირებადი ცილების ახალი ინტერმოლეკულური და ინტრამოლეკულური ჯვარედინი შეერთებები, როგორიცაა MX1, UP18, OAS3 და STAT1.გამოკვლეულია სხვადასხვა სტრუქტურული თავისებურებები და ურთიერთქმედება ფუნქციურ სფეროებში.
ურთიერთქმედება HLA-A-ს, MDN1-სა და H2B-ს შორის გამოვლინდა იმუნობლოტირებით Flo-1 და A549 უჯრედებში, რომლებსაც მკურნალობდნენ და არ მკურნალობდნენ IFNα.ჩვენი შედეგები ხაზს უსვამს, რომ HLA-A კომპლექსდება H2B-თან IFNα-დამოკიდებული გზით.ჩვენი ნამუშევარი წარმოადგენს საინტერესო გზას ამ ორი კომპლექსის ერთობლივი ლოკალიზაციის შემდგომი გამოკვლევისთვის.ასევე საინტერესო იქნებოდა CLMS მიდგომის გაფართოება უჯრედული ხაზების პანელზე, რათა დადგინდეს უჯრედის ტიპის დამოუკიდებელი ინტერფერონის შუამავლობით ცილოვანი ურთიერთქმედება.დაბოლოს, ჩვენ გამოვიყენეთ MD მოდელირება, როგორც ალტერნატიული მიდგომა H2BFS-HLA-A-HMGA1 კომპლექსში ჩართული ცილების კონფორმაციული დინამიკის გასაგებად, რომელიც თვალყურს ადევნებდა ინტრამოლეკულურ და ინტერმოლეკულურ ჯვარედინი საუბრებს.CLMS მონაცემებიდან მიღებული დასკვნები ვარაუდობს H2BFS, HLA-A და HMGA1 ცილების განსხვავებული კონფორმაციის შესაძლებლობას.შესაძლო განსხვავებულმა კონფორმაციებმა ამ დოკ პროტეინის კომპლექსებს შორის გამოავლინა რამდენიმე ურთიერთქმედება, რომელიც მსგავსია CLMS მონაცემთა ნაკრებში.ჩვენი მეთოდის ერთ-ერთი მთავარი უპირატესობა ის არის, რომ ის საშუალებას იძლევა ადვილად იდენტიფიცირება ურთიერთქმედების მაღალი პოლიმორფული გენების, როგორიცაა HLA, ამიტომ საინტერესო იქნება HLA ჰაპლოტიპისთვის სპეციფიკური ცილების ურთიერთქმედების შესწავლა, რომლებიც სხვაგვარად რთული შესასწავლია.ერთად აღებული, ჩვენი მონაცემები აჩვენებს, რომ CLMS შეიძლება გამოვიყენოთ ინტერფერონით გამოწვეული სასიგნალო ქსელების შესახებ ჩვენი გაგების გასაფართოვებლად და სიმსივნის მიკროგარემოში უფრო რთული უჯრედშორისი სისტემების შესასწავლად.
Flo-1 უჯრედები მიღებულ იქნა ATCC-დან და ინახებოდა DMEM-ში (Gibco), რომელსაც დაემატა 1% პენიცილინი/სტრეპტომიცინი (Invitrogen), 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი (Gibco) და ინახება 37°C-ზე და 5% CO2-ზე.ინკუბაცია.უჯრედები გაიზარდა 70-80% შესართავამდე IFNα14-ით დამუშავებამდე (დამზადებულია ედინბურგის პროტეინის წარმოების დაწესებულებაში).ყველა სხვა ქიმიკატი და რეაგენტი შეძენილია Sigma Aldrich-ისგან, თუ სხვა რამ არ არის აღნიშნული.
Flo-1 უჯრედები კულტივირებული იყო 6 ჭაბურღილ ფირფიტებში და მეორე დღეს უჯრედები დამუშავდა 10 ნგ/მლ IFNα14 24 საათის განმავლობაში, დაახლოებით 80% შერწყმამდე.უჯრედები გარეცხილი იქნა სამჯერ PBS-ით და ლიგირებული იქნა ახლად მომზადებული DSS-ით (Thermo Fisher Scientific) (იხსნება DMSO-ში) PBS-ში 5 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე საბოლოო კონცენტრაციამდე 0.5 მმ.DSS ჯვარედინი კავშირის რეაქცია შეიცვალა PBS-ით და ნარჩენი DSS ჩაქრა 20 მმ ტრის (pH 8.0) დამატებით PBS-ში 15 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე.უჯრედები შეგროვდა გახეხვით და შეგროვდა დაბალი შეკვრის მილებში (Axygen).
უჯრედის მარცვლები ლიზირებული იყო 300 μl შარდოვანას ლიზის ბუფერთან (8 მ შარდოვანა, 0.1 მ ტრისი, pH 8.5) 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე პერიოდული შერყევით.ცენტრიფუგაციის ყველა ეტაპი შესრულდა 14000 xg 8°C-ზე.გაატარეთ ლიზატის ცენტრიფუგა 10 წუთის განმავლობაში და გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მილში.დარჩენილი გამჭვირვალე ნაწილაკები იხსნება 150 მკლ მეორე ლიზის ბუფერში (2 M შარდოვანა, 2% (w/v) SDS (ნატრიუმის დოდეცილ სულფატი)) 30 წუთის განმავლობაში ან მეტი, სანამ ერთგვაროვანი წყალხსნარი მიიღება.ლიზატი იყო ცენტრიფუგირებული 20 წუთის განმავლობაში და სუპერნატანტი შერეული იყო წინა ეტაპზე მიღებულ ლიზატთან.ცილის კონცენტრაცია შეფასდა Micro BCA ანალიზის გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით მიკროპლასტიკური პროცედურების შესახებ.ნიმუშები სწრაფად გაიყინა თხევად აზოტში და ინახებოდა -80°C-ზე.
დაახლოებით 100 მკგ ხსნადი ჯვარედინი დაკავშირებული ცილა დამუშავდა მოდიფიცირებული ფილტრაციის ნიმუშის მომზადების პროტოკოლის (FASP) გამოყენებით, როგორც აღწერილია ვისნიევსკის და სხვების მიერ.69 მოკლედ, ცილა ჯვარედინი კავშირშია 200 μl შარდოვანას ბუფერთან (8 მ შარდოვანა 0,1 მ ტრისში, pH 8,5), მორევა და განახევრება.ცენტრიფუგაციის ყველა ეტაპი შესრულდა 14000 xg 25°C-ზე.ჯვარედინი დაკავშირებული პროტეინის ლიზატის პირველი ნახევარი გადატანილი იქნა 10 kDa Microcon ცენტრიფუგა ფილტრის მოწყობილობაში, რომელიც აღჭურვილი იყო Ultracel-10 მემბრანით (Merck), რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგაცია ფილტრზე 25 წუთის განმავლობაში.შემდეგ დაამატეთ ცილის მეორე ნახევარი ფილტრში და გაიმეორეთ იგივე ნაბიჯები.ცილის აღდგენა განხორციელდა შარდოვანას ბუფერში 100 მკლ 17 მმ ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინის ჰიდროქლორიდის (TCEP) დამატებით.აღდგენას ურევენ თერმომიქსერზე 600 rpm-ზე 30 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე.გარდა ამისა, სვეტი იყო ცენტრიფუგირებული და შემცირებული ჯვარედინი დაკავშირებული ცილა ალკილირდა 100 μl 50 მმ იოდოაცეტამიდის გამოყენებით შარდოვანას ბუფერში.ალკილირების რეაქცია ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში სიბნელეში.მოატრიალეთ სვეტი, გარეცხეთ სვეტის კედლები 3-ჯერ 100 μl შარდოვანას ბუფერით და შემდეგ ცენტრიფუგა.იგივე ოპერაცია ჩატარდა 3-ჯერ 100 μl 100 მმ ამონიუმის ბიკარბონატის გამოყენებით.ტრიფსინიზაციამდე შეცვალეთ შეგროვების მილი ახლით.დაამატეთ საჭმლის მონელების ბუფერი, რომელიც შეიცავს 50 მმ ამონიუმის ბიკარბონატს და 1 μl ტრიფსინს, განზავებულ ტრიფსინის ბუფერში (პრომეგა).ტრიპსინის თანაფარდობა პროტეინთან შენარჩუნებული იყო დაახლოებით 1:33 და მონელების რეაქციები ინკუბირებული იყო ღამით 37°C-ზე ტენიან კამერაში.ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდი გამოიდევნა ფილტრიდან ცენტრიფუგაციით 25 წუთის განმავლობაში.პეპტიდის აღდგენა გაუმჯობესდა ფილტრში 50 μl 0.5 M NaCl-ის დამატებით, რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგაცია 25 წუთის განმავლობაში.
C18 მიკრო სპინის სვეტები (ჰარვარდის აპარატი) გამოყენებული იყო ჯვარედინი ტრიპტიური პეპტიდების დასამარილებლად, Bouchal et al.70-ის მიერ აღწერილი პროტოკოლის შესაბამისად მცირე ცვლილებებით.მოკლედ, C18 სპინის სვეტები გააქტიურდა სამი გამორეცხვით 0.1% ჭიანჭველა მჟავით (FA) აცეტონიტრილში (AcN) (Merck) და ორი გამორეცხვით 0.1% FA.სვეტი იყო დატენიანებული 0.1% FA 15 წუთის განმავლობაში.ჩასვით ნიმუშები დაწნულ სვეტებში და გარეცხეთ 3-ჯერ 0.1% FA.მარილიანი პეპტიდები თანმიმდევრულად გამოირეცხებოდა ეტაპობრივი გრადიენტით 50%, 80% და 100% AcN-ის გამოყენებით 0.1% FA-ში.ნიმუშები გაშრეს SpeedVac Plus-ის კონცენტრატორში (Eppendorf), სანამ ნარჩენი სითხე მთლიანად არ გაქრებოდა.გამორეცხილი პეპტიდები იხსნება 100 μl 0.08% ტრიფტორძმარმჟავაში 2.5% AcN-ში და კონცენტრაციები გაზომილი იყო NanoDrop 2000-ზე (Thermo Scientific).დაახლოებით 1 მკგ ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდი თითო ნიმუშზე იყო შეყვანილი LC-MS/MS სისტემაში.
ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდები გამოეყო UltiMate 3000 RSLCnano LC სისტემაზე (Thermo Scientific), რომელიც დაკავშირებულია Orbitrap Exploris 480 მასის სპექტრომეტრთან (Thermo Scientific).ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდები შეგროვდა 300 μm ID, 5 მმ სიგრძის μ-სვეტის წინ C18 დაჭერის სვეტზე, შეფუთული C18 PepMap100 სორბენტით და 5 μm PepMap სორბენტით (Thermo Scientific).ჩატვირთეთ ტუმბოს ნაკადი დაყენებული 5 მკლ/წთ 0.08% ტრიფტორძმარმჟავა გახსნილი 2.5% AcN-ში.ჯვარედინი დაკავშირებული პეპტიდები გამოეყო 75 მკმ შიდა დიამეტრით და 150 მმ სიგრძის ანალიზურ მდნარ სილიციუმის სვეტზე, სავსე 2 μm PepMap სორბენტით (Thermo Scientific).მობილური ფაზები A და B შედგებოდა 0.1% FA წყალში და 0.1% FA აცეტონიტრილში, შესაბამისად.გრადიენტი იწყება 2.5% B-დან და იზრდება ხაზოვანი 40% B-მდე 90 წუთის განმავლობაში, შემდეგ 90% B-მდე მომდევნო 2 წუთის განმავლობაში.მობილური ფაზის შემადგენლობა შენარჩუნდა 90% B-ზე 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ შემცირდა ხაზობრივად 2.5% B-მდე 2 წუთის განმავლობაში.სვეტი დაბალანსებული იყო 2.5% B-ზე 8 წუთის განმავლობაში მომდევნო ციკლამდე.ანალიტიკური სვეტიდან გამორეცხილი ჯვარედინი პეპტიდები იონიზირებული იყო ნანოელექტროსპრეის იონიზაციის (NSI) წყაროში და ინექცია Exploris 480 მასის სპექტრომეტრში (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 მასობრივი სპექტრომეტრი მუშაობდა მონაცემთა დადებითი კორელაციის რეჟიმში.სრული სკანირება განხორციელდა განყოფილების რეჟიმში 120,000 გარჩევადობით, დიაპაზონის პარამეტრებით m/z 350 Th-დან m/z 2000 Th-მდე.ნორმალიზებული AGC სამიზნე დაყენებული იყო 300%-ზე, მაქსიმალური შეყვანის დროით 50 ms.პეპტიდებისთვის დადგენილია მონოიზოტოპური პიკის გამოვლენა.შეზღუდვის რელაქსაციის პარამეტრი დაყენებულია ჭეშმარიტად, თუ ძალიან ცოტა წინამორბედი იქნება ნაპოვნი.წინამორბედის მინიმალური იონური სიძლიერე დაყენდა 5.0e3-ზე და წინამორბედის მუხტის მდგომარეობა +8-მდე ჩართული იყო ექსპერიმენტებში.
ციკლის დრო ძირითად სკანირებას შორის მონაცემთა კორელაციის რეჟიმში დაყენებული იყო 2,5 წამზე.დინამიური მასის გამორიცხვა დაყენდა 20 წმ-ზე წინამორბედი იონის პირველი ფრაგმენტაციის შემდეგ.წინამორბედის იზოლაციის ფანჯარა დაყენებული იყო 2 Th.შეჯახების ენერგიის ნორმალიზებული ტიპი ფიქსირებული შეჯახების ენერგიის რეჟიმში არჩეული იყო მონაცემებზე დამოკიდებული MS/MS სკანირებით.შეჯახების ენერგია დაყენებულია 30%-ზე.ორბიტრაპის გარჩევადობა დაყენებული იყო 15000-ზე, ხოლო AGC-ის სამიზნე 100%-ზე.მორგებული მაქსიმალური ინექციის დრო დაყენებულია 60 მილიწამამდე.
ჯვარედინი დაკავშირებულ ნიმუშებში ცილოვან-პროტეინის ქსელის თვალყურის დევნებამდე, ჩვენ დავამუშავეთ ნედლეული ფაილები MaxQuant პაკეტის (ვერსია 1.6.12.0)26,27, ნიმუშებში მიკვლევადი პეპტიდების/პროტეინების დასადგენად.გარდა ამისა, მსგავსი პროტეომიური ანალიზები ჩატარდა IFNα-თ დამუშავებულ და დაუმუშავებელ Flo-1 ნიმუშებზე.MS/MS მონაცემები მოძიებული იქნა UniProt ადამიანის მონაცემთა ბაზაში (www.uniprot.org) (ატვირთულია 2020 წლის 12 აგვისტო, შეიცავს 75,093 ჩანაწერს) ჩაშენებული საძიებო სისტემის Andromeda27-ის გამოყენებით.ძიება ჩატარდა ფერმენტის სპეციფიკურობისა და დეამიდაციის (N, Q) და დაჟანგვის (M) სხვადასხვა მოდიფიკაციის მითითების გარეშე.წინამორბედის მასის ტოლერანტობა დაყენებული იყო 20 ppm და პროდუქტის იონები 0.02 Da.საწყისი და მაქსიმალური მასის გადახრა დაყენდა 10 ppm.პეპტიდის მაქსიმალური მასა დაყენებული იყო 4600 Da-ზე და თანმიმდევრობის მსგავსება დაყენებული იყო 7 და 25 ამინომჟავას შორის (aa).შემდგომი სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა Perseus პროგრამის გამოყენებით (ვერსია 1.6.10.45).პროტეინის შემცველობა გამოითვალა ცილის სპექტრული ინტენსივობის ნორმალიზებით (LFQ ინტენსივობა; დაუწერელი რაოდენობები)27 და ინტენსივობის მნიშვნელობები გადაკეთდა Log2-ში.ცილების იერარქიული კლასტერირება, რომელიც იდენტიფიცირებულია მათი პეპტიდის ინტენსივობით, აშენდა pheatmap (v1.0.12) პაკეტის გამოყენებით R (v 4.1.2).გზის გამდიდრების ანალიზი ჩატარდა Reactome ბილიკის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით IFNα დამუშავებული პროტეინებისთვის, რომლებიც ოთხჯერ მეტი იყო გააქტიურებული არანამკურნალევ ნიმუშებთან შედარებით.
LC-MS/MS-ით მონიტორირებული ცილის კომპლექსების ლიზინის (K) ან სერინის (S) სპეციფიკური ქიმიური ჯვარედინი ბმულების იდენტიფიკაცია განხორციელდა ჯვარედინი პეპტიდების (SIM-XL)29 სპექტროსკოპიული იდენტიფიკაციის აპარატის (SIM-XL) გამოყენებით.პირველი, შესაძლო ურთიერთქმედება ინტერფერონთან ასოცირებულ (IFN) დნმ-ის დაზიანების რეზისტენტობის ხელმოწერის (IRDS) გენებს შორის გამოკვლეული იყო IRDS ცილის მონაცემთა ნაკრების გამოყენებით, რომელიც აღწერილია Padariya et al.28-ში.მთელი ადამიანის UniProt-ის ყველა მდგომარეობისა და გამეორების სკრინინგი გამოთვლითი ინტენსიურია, ამიტომ მთელი ადამიანის UniProt მონაცემთა ბაზა (www.uniprot.org) (ჩამოტვირთულია 2020 წლის 12 აგვისტო, შეიცავს 75,093 ჩანაწერს) IFNα-თ დამუშავებული გამეორებების წინააღმდეგ.ერთ-ერთი ფილტრი მაღალი ნდობის ურთიერთქმედებისთვის.მიღებული ეს მაღალი მნიშვნელობის ურთიერთქმედება გაფართოვდა და გამოცდა ყველა გამეორებასა და პირობებში.
SIM-XL-ში DSS გამოიყენებოდა კროსლინკერისთვის (XL) და XL წონის ცვლა და მოდიფიკაციის წონის ცვლა დაყენებული იყო 138.06 და 156.07 შესაბამისად.განიხილება შემდეგი ჯვარედინი რეაქციის ადგილები: KK, KS და KN-TERM, მომხსენებელი იონების გარეშე.ორივე წინამორბედი და ფრაგმენტი ppm დაყენებული იყო 20-ზე და Xrea ბარიერი დაყენებული იყო 0.15-ზე.ტრიპსინი ჩაითვალა სრულიად სპეციფიკურად და განხორციელდა მაღალი ენერგიის C-ხაფანგის (HCD) ფრაგმენტაციის მეთოდი.XCorr დინამიური DB შემცირების ბარიერი და პეპტიდების მინიმალური რაოდენობა DB დინამიური შემცირებისთვის დაყენებული იყო 2.5 და 2, შესაბამისად.სხვა პარამეტრებია: მონოიზოტოპის ალბათობა და პიკის დამთხვევის წყვეტა, მინიმუმ 4 AA ნარჩენი ერთ ძაფზე და ჯაჭვის მაქსიმალური დამუხტვა და 3 გამოტოვებული გაყოფის მაქსიმუმი.შედეგად შეკერილი 2D რუკები გაანალიზდა (SIM-XL) და xQuest28 გრაფიკული წარმოდგენა გამოყენებული იქნა 2D რუქების შესაქმნელად.პროტეინის ჯვარედინი ბმულები ცილის სტრუქტურებზე მოცემულია PyMol-ში (PyMOL Molecular Graphics System, ვერსია 2.0 Schrödinger, LLC).
პროტეინის მოდელის სტრუქტურები შეიქმნა Phyre2 სერვერის (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 გამოყენებით ჰომოლოგიური მოდელირებისა და "ფარული მარკოვის მეთოდის" დანერგვის პრინციპების გამოყენებით.Phyre2 წარმოქმნის მოდელის სტრუქტურებს ცნობილ ცილის სტრუქტურებთან მიმდევრობის გასწორების საფუძველზე.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 და MDN1 პროტეინებისთვის გამოყენებული იყო შაბლონის სტრუქტურები 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 და 6i2665.გარდა ამისა, განხილული იქნა AlphaFold71 MX1, UBP18 და ROBO1 სტრუქტურაც.ცილის სტრუქტურის ვიზუალიზაცია მოხდა BIOVIA Discovery Studio Visualizer პაკეტის (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) და Molecular Operating Environment პაკეტის (MOE; Chemical Computing Group Inc., მონრეალი, კვებეკი, კანადა) გამოყენებით.