ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 დუპლექსის შედუღებული მილაკი ქიმიური მრეწველობის ქიმიური კომპონენტისთვის, SPECC1L-ის დეფიციტი იწვევს შებმული სახსრების სტაბილურობის გაზრდას და კრანიალური ნერვული ღერძის უჯრედების დაცლის შემცირებას.

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 დუპლექსის შედუღებული მილი ქიმიური მრეწველობისთვის

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.არის წამყვანი მწარმოებელი, რომელიც სპეციალიზირებულია უჟანგავი ფოლადის უჟანგავი მილების, კაშკაშა ანეილირებული მილების, უწყვეტი დახვეული მილების და ა.შ.მომხმარებელთა გასაადვილებლად ჩვენ შედუღებული გვაქვს მილები და მილებიც.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.აქვს ყველაზე მოწინავე საწარმოო და ტესტირების აღჭურვილობა.ჩვენ შეგვიძლია სრულად დავაკმაყოფილოთ თქვენი მოთხოვნა.ძალიან მკაცრად სტანდარტის მიხედვით, ჩვენს მიერ წარმოებულ მილებს ყოველთვის აქვთ სწორი OD და WT ტოლერანტობა.ტოლერანტობის კონტროლი მკაცრად შეესაბამება სტანდარტებს.ჩვენი პროდუქცია ყოველთვის კმაყოფილია მომხმარებლებით.მომხმარებლებმა შეიძინეს ჩვენი პროდუქცია, შექმნეს მეტი მოგება.
ა) OD (გარე დიამეტრი): 3.18 მმ-დან 101.6 მმ-მდე
ბ) WT (კედლის სისქე): 0.5 მმ-დან 20 მმ-მდე
გ) სიგრძე: მომხმარებლის მოთხოვნის შესაბამისად
დ) სტანდარტები: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 და ა.შ
ე) პროცესის მეთოდი: ERW, EFW და ა.შ

სლაიდერები, რომლებიც აჩვენებს სამ სტატიას თითო სლაიდზე.გამოიყენეთ უკანა და შემდეგი ღილაკები სლაიდებში გადასაადგილებლად, ან სლაიდის კონტროლერის ღილაკები ბოლოს თითოეულ სლაიდში გადასაადგილებლად.
კრანიალური ნეირონული თხემის უჯრედები (CNCC) იშლება ემბრიონის ნერვული ნაკეცებიდან და მიგრირებენ ფარინგეალური თაღებისკენ, რომლებიც ქმნიან შუა სახის სტრუქტურების უმეტეს ნაწილს.CNCC დისფუნქცია მნიშვნელოვან როლს ასრულებს პირის ღრუს ნაპრალის ეტიოლოგიაში, საერთო თანდაყოლილი მანკი.ჰეტეროზიგოტური SPECC1L მუტაციები აღმოჩენილია პაციენტებში ატიპიური და სინდრომული ჭრილობებით.აქ, ჩვენ ვახსენებთ კანონიკური წებოვანი შეერთების (AJ) კომპონენტების, β-კატენინისა და E-კადჰერინის გაძლიერებულ შეღებვას კულტივირებულ SPECC1L ნოკდაუნის უჯრედებში, ხოლო ელექტრონული მიკროგრაფიები აჩვენებს AJ-ის აპიკალურ-ბაზალურ დიფუზიას.SPECC1L-ის როლის გასაგებად კრანიოფიალურ მორფოგენეზში, ჩვენ შევქმენით Specc1l დეფიციტური თაგვის მოდელი.ჰომოზიგოტური მუტანტები ემბრიონის ლეტალურია და ავლენენ ნერვული მილის დახურვის და CNCC ლამინირების დარღვევას.AJ პროტეინის შეღებვა იზრდება მუტანტურ ნერვულ ნაკეცებში.ეს AJ დეფექტი შეესაბამება CNCC დელამინაციის დეფექტს, რომელიც მოითხოვს AJ დაშლას.გარდა ამისა, Specc11 მუტანტებმა შეამცირეს PI3K-AKT სიგნალიზაცია და გაზარდეს აპოპტოზი.ინ ვიტრო, PI3K-AKT სიგნალიზაციის მსუბუქი დათრგუნვა ველური ტიპის უჯრედებში საკმარისი იყო AJ ცვლილებების გამოსაწვევად.მნიშვნელოვანია, რომ AJ ცვლილებები გამოწვეული SPECC1L დარტყმით, შეიძლება შეიცვალოს PI3K-AKT გზის გააქტიურებით.ერთად აღებული, ეს მონაცემები ვარაუდობს, რომ SPECC1L, როგორც PI3K-AKT სიგნალიზაციისა და AJ ბიოლოგიის ახალი რეგულატორი, საჭიროა ნერვული მილის დახურვისა და CNCC სტრატიფიკაციისთვის.
კრანიალური ნეირონული თხემის უჯრედები (CNCCs) ლოკალიზდება დორსალურ ნეიროექტოდერმაში და იშლება განვითარებადი ნერვული ნაკეცების ნეიროეპითელიუმიდან ეპითელურ-მეზენქიმური გადასვლის (EMT) 1,2,3 პროცესის მეშვეობით.პრემიგრაციული ეპითელური CNCC არღვევს უჯრედშორისი შეერთებებს და ხდება მიგრირებადი მეზენქიმული CNCC, რომლებიც ავსებენ პირველ და მეორე ფარინგეალურ თაღებს და ქმნიან კრანიოფიალური ხრტილის დიდ ნაწილს.ამრიგად, გენები, რომლებიც არეგულირებენ CNCC ფუნქციას, ხშირად დარღვეულია კრანიოფიალური თანდაყოლილი ანომალიების ეტიოლოგიაში, როგორიცაა პირსახის ნაპრალები, ყველაზე ხშირად მხოლოდ აშშ-ში დაბადებულთა 1/800-ზე გავლენას ახდენს.ერთ-ერთი თანდაყოლილი დეფორმაცია8.
CNCC-ის დაშლა ემთხვევა წინა ნერვული მილის დახურვას თაგვებში ემბრიონის განვითარების 8,5-დან 9,5 დღემდე.თაგვის პირსახის ნაპრალთან დაკავშირებული რიგი გენების მუტანტები ასევე ავლენენ ნერვული მილის დეფექტის გარკვეულ ფორმას, მათ შორის Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 და Pdgfrα12.თუმცა, ნერვული მილის დახურვის და CNCC სტრატიფიკაციის პროცესები შეიძლება ჩაითვალოს დამოუკიდებლად, რადგან Splotch მუტანტის თაგვი (Pax3) ავლენს დეფექტებს ნერვული მილის დახურვისას CNCC სტრატიფიკაციისა და მიგრაციის შესახებ რაიმე გავლენის გარეშე 13,14.თაგვის დამატებითი მოდელები CNCC დისექციისა და ნერვული მილის დახურვის დეფექტებით დაგეხმარებათ ამ ორი პროცესის საერთო მოლეკულური საფუძვლის განსაზღვრაში.
ნეიროეპითელური უჯრედებიდან CNCC-ის გამოყოფა მოითხოვს ადჰეზიური კვანძების (AJs) დაშლას, რომლებიც შედგება ცილოვანი კომპლექსებისგან, რომლებიც შეიცავს, სხვათა შორის, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin და α-actinin, რომლებიც დაკავშირებულია აქტინის ძაფებთან 2. ზედმეტად გამოხატვის კვლევებმა E-cadherin-მა ნერვულ ნაკეცებში აჩვენა CNCC-ის დელიმინაციის შემცირება ან შეფერხება.პირიქით, E-cadherin-ის დათრგუნვა იწვევს ადრეულ სტრატიფიკაციას15,16.მრავალი ფაქტორი, რომელიც შუამავლობს EMT-ს CNCC სტრატიფიკაციის დროს, არის ტრანსკრიფციის ფაქტორები (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) და უჯრედგარე მატრიქსის (ECM) რემოდელირების პროტეინები, როგორიცაა მატრიქსის მეტალოპროტეინაზები (MMPs), თუმცა CNCC არის პირდაპირი ციტოსკელეტი. ჯერ არ არის ცნობილი.ცნობილია, რომ PI3K-AKT გზა ანტაგონირებს E-კადჰერინის დონეს, ძირითადად კიბოს კვლევის შედეგად17.ბოლო კვლევებმა აჩვენა, რომ PDGFα-ზე დაფუძნებული PI3K-AKT სიგნალის დაკარგვა თაგვებში იწვევს კრანიოფიალურ ანომალიებს, მათ შორის სასის და ნერვული მილის დეფექტებს12.თუმცა, კავშირი PI3K-AKT გზასა და AJ სტაბილურობას შორის CNCC სტრატიფიკაციაზე გაურკვეველია.
ჩვენ ადრე დავადგინეთ SPECC1L, როგორც პირველი მუტანტის გენი ორ ადამიანში მძიმე ნაპრალის მქონე, რომელიც ვრცელდება პირიდან თვალამდე, რომელიც ცნობილია როგორც ირიბი ნაპრალი (ObFC) ან Tessier IV18 ნაპრალი.SPECC1L მუტაციები გამოვლენილია ორ მრავალთავიან ოჯახში აუტოსომური დომინანტური Opitz G/BBB სინდრომით (OMIM #145410), რომელშიც დაზარალებული პირები აჩვენებდნენ ჰიპერდისტანციას და ტუჩის/სასის ნაპრალს19 და ერთ ოჯახში თიბის ჭარბი დისტანციის სინდრომით (OM42014) .Opitz G/BBB სინდრომის შემთხვევების ნახევარზე მეტი X-დაკავშირებულია (OMIM #300000) და გამოწვეულია MID1 გენის მუტაციებით, რომელიც აკოდირებს მიკროტუბულებთან ასოცირებული უჯრედის ჩონჩხის პროტეინს 22.ჩვენ ვარაუდობთ, რომ SPECC1L, ასევე ცილა, რომელიც დაკავშირებულია მიკროტუბულებთან და აქტინის ციტოჩონჩხთან, შეიძლება შუამავლობდეს აქტინის ციტოჩონჩხის რემოდელირებისთვის საჭირო სიგნალიზაციას უჯრედის ადჰეზიისა და მიგრაციის დროს 18 .in vitro და in vivo კვლევების საშუალებით, ჩვენ ახლა აღვწერთ SPECC1L, როგორც AJ სტაბილურობის ახალ მარეგულირებელს PI3K-AKT სიგნალიზაციის საშუალებით.უჯრედულ დონეზე, SPECC1L დეფიციტმა გამოიწვია პან-AKT ცილის დონის დაქვეითება და AJ-ის აპიკალურ-ბაზალური დისპერსიის ზრდა, რაც აღმოიფხვრა AKT გზის ქიმიური გააქტიურებით.In vivo, Spec11-დეფიციტური ემბრიონები აჩვენებენ ნერვული მილის დახურვის დარღვევას და შემცირებულ CNCC დისექციას.ამრიგად, SPECC1L ფუნქციონირებს უჯრედის ადჰეზიაზე დაფუძნებულ მაღალ რეგულირებულ სიგნალიზაციაში, რომელიც საჭიროა CNCC ნორმალური ფუნქციისთვის სახის მორფოგენეზის დროს.
SPECC1L-ის როლის ფიჭურ დონეზე დასახასიათებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ ადრე აღწერილი სტაბილური ოსტეოსარკომის უჯრედული ხაზი U2OS დეფიციტი SPECC1L18-ში.ამ სტაბილურ U2OS უჯრედებს SPECC1L (kd) ნოკდაუნით ჰქონდათ SPECC1L ტრანსკრიპტების და ცილების დონის ზომიერი (60-70%) დაქვეითება, დეფექტებთან ერთად აქტინის ციტოჩონჩხის მიგრაციასა და რეორგანიზაციაში 18. ამის საპირისპიროდ, მძიმე გარდამავალი დაქვეითება ნაჩვენებია, რომ SPECC1L იწვევს მიტოზურ დეფექტებს 23 .შემდგომი დახასიათების შემდეგ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ჩვენმა სტაბილურმა SPECC1L-kd უჯრედებმა შეცვალეს მორფოლოგია შერწყმის ძალიან მაღალი ხარისხით (სურათი 1).ცალკეული საკონტროლო უჯრედები და kd უჯრედები დაბალ შესართავთან ერთნაირად გამოიყურებოდა (სურათი 1A,D).შერწყმიდან 24 საათის შემდეგ, საკონტროლო უჯრედებმა შეინარჩუნეს კუბოიდური ფორმა (ნახ. 1B, E), ხოლო SPECC1L-kd უჯრედები წაგრძელდა (ნახ. 1C, F).უჯრედის ფორმის ამ ცვლილების მასშტაბი დაფიქსირდა საკონტროლო უჯრედებისა და kd უჯრედების in vivo ცოცხალი გამოსახულების საშუალებით (ფილმი 1).SPECC1L-ის როლის დასადგენად კონფლენტურ უჯრედებში, ჩვენ პირველად გამოვიკვლიეთ მისი გამოხატულება.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ SPECC1L ცილის დონეები გაიზარდა შერწყმისას (სურათი 1G), ხოლო SPECC1L ტრანსკრიპტის დონე არ გაიზარდა (სურათი 1H).გარდა ამისა, უჯრედების სიმკვრივის მატებასთან ერთად, SPECC1L ცილა დაგროვდა უჯრედშორის საზღვრებზე (ნახ. 2A-E), მემბრანასთან ასოცირებულ β-კატენინის ნიმუშით (ნახ. 2A'-E').SPECC1L-ის ასოციაციის გათვალისწინებით აქტინის ციტოჩონჩხთან 18,23, ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ SPECC1L ურთიერთქმედებს აქტინზე დაფუძნებულ წებოვან შეერთებებთან (AJ).
(AF) SPECC1L ნოკდაუნის (DF) უჯრედები გრძელდება მაღალ შესართავთან (F) საკონტროლო U2OS უჯრედებთან (AC) შედარებით.აქ ნაჩვენებია ექვსი დროის წერტილიდან სამი (T1, T3, T6), რომლებიც შევარჩიეთ უჯრედების სხვადასხვა სიმკვრივისთვის.(G) Western blot ანალიზი, რომელიც აჩვენებს, რომ SPECC1L ცილა სტაბილიზირებულია შერწყმის მაღალ ხარისხზე საკონტროლო უჯრედებში შერწყმის დაბალ ხარისხთან შედარებით.SPECC1L-ის Western blot გვიჩვენებს მოსალოდნელ 120 kDa დიაპაზონს და უფრო მაღალი მოლეკულური წონის დიაპაზონს, შესაძლოა პოსტტრანსლაციურად შეცვლილი (*).Western blot ანალიზი ჩატარდა იმავე პირობებში დაბალი და მაღალი შესართავისთვის.სურათები, რომლებიც აჩვენებენ SPECC1L-ს დაბალ და მაღალ შესართავზე, აღებულია ერთი და იგივე ბლოტიდან.იგივე ბლატი ამოიღეს და ხელახლა გამოიკვლიეს β-აქტინის ანტისხეულით.(H) რაოდენობრივმა RT-PCR ანალიზმა არ აჩვენა მნიშვნელოვანი ცვლილებები SPECC1L ტრანსკრიპტის დონეებში.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს SEM-ებს ოთხი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.
(AE) ჩვენ ავირჩიეთ ექვსი დროის წერტილი (T1-T6), რომელიც წარმოადგენს უჯრედების სიმკვრივის დიაპაზონს, რათა ნორმალიზდეს უჯრედის ფორმის ანალიზი და AJ ცვლილებები U2OS უჯრედებში SPECC1L ნოკდაუნით (kd).ამ დროის პირველი ხუთეული მოიცავდა ერთ უჯრედს (T1), მცირე უჯრედების კლასტერების 50-70% შერწყმას (T2), შერწყმას kd უჯრედების გადაფორმების გარეშე (T3), kd უჯრედების ფორმის შეცვლას (T4) და 24 საათიან ცვლილებებს.kd (T5) უჯრედების უკანა სახით.SPECC1L ცილა უპირატესად დისპერსიული იყო ციტოპლაზმაში T1 (A), მაგრამ მისი დაგროვება შეინიშნებოდა უჯრედშორის საზღვრებზე მომდევნო დროის წერტილებში (B–E, ისრები).(FJ) β-კატენინი გვიჩვენებს მსგავს დაგროვებას უჯრედშორის საზღვრებზე, რომლებიც დაკავშირებულია AJ კომპლექსთან.(A'-E') SPECC1L და β-კატენინი აჩვენებენ გადახურულ შეღებვას უჯრედის საზღვრებზე მაღალი უჯრედის სიმკვრივით (ისრები).(F'-J') SPECC1L-kd უჯრედებში β-კატენინის შეღებვა ნორმალური ჩანს უჯრედის დაბალი სიმკვრივის დროს (F'-H'), მაგრამ ფართოვდება უჯრედის ფორმის ცვლილებისას (I', J'; ისრები), რაც მიუთითებს, რომ AJ შეიცვალა.ზოლები = 10 მკმ.
შემდეგ ჩვენ შევეცადეთ დაგვედგინა SPECC1L დეფიციტის ეფექტი AJ-ზე.ჩვენ გამოვიყენეთ რამდენიმე AJ-თან დაკავშირებული მარკერი, მათ შორის კანონიკური კომპონენტები F-actin, myosin IIb, β-catenin და E-cadherin24,25,26,27.აქტინის სტრესის ბოჭკოები გაიზარდა SPECC1L-kd უჯრედებში, როგორც ადრე იყო აღწერილი (ნახ. 3A,B) 18.მიოზინი IIb ასოცირებული აქტინის ძაფებთან აჩვენა მსგავსი ზრდა SPECC1L-kd უჯრედებში in vitro (ნახ. 3C,D).AJ-თან ასოცირებული β-კატენინი უჯრედის მემბრანაზე აკავშირებს კადერინს, რაც აჩვენებს ნორმალურ „თაფლისებრ“ ექსპრესიის ნიმუშს საკონტროლო კუბოციტებში (ნახ. 3E,G).საინტერესოა, რომ ბრტყელ სურათებში კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით, β-კატენინი (ნახ. 3E,F) და E-კადჰერინი (ნახ. 3G,H) შეღებვამ SPECC1L-დეფიციტური უჯრედების უჯრედის მემბრანაზე აჩვენა გაფართოებული შეღებვის აშკარა ნიმუშები.AJ-თან ასოცირებული β-კატენინის შეღებვის ეს გაფართოება kd უჯრედებში იყო ყველაზე გამოხატული შესართავისას, მაგრამ, როგორც ჩანს, წინ უსწრებდა უჯრედის ფორმის ცვლილებებს (ნახ. 2F-J, F'-J').ამ გაფართოებული AJ შეღებვის ფიზიკური ბუნების დასადგენად, ჩვენ გამოვიკვლიეთ უჯრედის საზღვრები SPECC1L-kd U2OS უჯრედების აპიკალურ-ბაზალურ ზედაპირზე გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპით (TEM) (სურათი 3I,J).საკონტროლო უჯრედებისგან განსხვავებით (ნახ. 3I), რომლებსაც ჰქონდათ ცალკეული ელექტრონული მკვრივი რეგიონები, რომლებიც მიუთითებს AJ-ზე (ისრები), kd უჯრედები (ნახ. 3J) აჩვენებდნენ მაღალი ელექტრონის სიმკვრივის დიდ, მომიჯნავე რეგიონებს, რომლებიც მიუთითებს AJ-ზე აპიკობაზალური სიბრტყის გასწვრივ..გარდა ამისა, განივი მონაკვეთებზე, ჩვენ დავაკვირდით უჯრედის მემბრანის ფართო ნაკეცებს kd უჯრედებში (ნახ. S1A,B), რაც ხსნის β-კატენინის და E-კადჰერინის შეღებვის ზოლების გაფართოებულ ნიმუშს (ნახ. 3F,H).SPECC1L-ის როლის მხარდასაჭერად AJ-ებში, β-კატენინი იყო ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაცია SPECC1L-თან ერთად შერწყმული U2OS უჯრედების ლიზატებში (ნახ. 3K).AJ მარკერებისთვის გაფართოებულ იმუნოშეღებვასთან ერთად, TEM ანალიზი შეესაბამებოდა ჩვენს ჰიპოთეზას, რომ SPECC1L დეფიციტი ზრდის AJ-ის აპიკალურ-ბაზალურ სიმკვრივეს და დისპერსიას.
(AH) გაზრდილი F-აქტინის შეღებვა kd უჯრედებში შერწყმის შემდეგ 48 საათის შემდეგ (T6; A, B).მიოზინის IIb-ის შეცვლილი შეღებვა დაკავშირებული F-აქტინთან (C, D).β-კატენინის და E-კადჰერინის მემბრანის შეღებვის გლუვი ნიმუში საკონტროლო უჯრედებში (E, G) გაძლიერდა SPECC1L-kd (F, H) უჯრედებში.ზოლები = 10 მკმ.(I–J) ელექტრონული მიკროგრაფიები, რომლებიც აკვირდებიან აპიკალურ-ბაზალურ უჯრედშორის შეერთებას.საკონტროლო უჯრედები აჩვენებენ განსხვავებულ ელექტრონზე მკვრივ რეგიონებს, რომლებიც მიუთითებენ წებოვან შეერთებაზე (I, ისრები).ამის საპირისპიროდ, SPECC1L-kd უჯრედებში მთელი აპიკალურ-ბაზალური შეერთება ელექტრონულად მკვრივი ჩანდა (J, ისრები), რაც მიუთითებს წებოვანი შეერთების გაზრდილ სიმკვრივესა და დისპერსიაზე.(K) β-კატენინი იყო ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაცია SPECC1L-თან ერთად შერწყმული U2OS უჯრედის ლიზატებში.სურათი გადაღებულია ერთი ადგილიდან, რომელიც წარმოადგენს ოთხი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან ერთ-ერთს.
SPECC1L-ის როლის გასაგებად კრანიოფიაციალურ მორფოგენეზში, ჩვენ შევქმენით Spec1l დეფიციტური თაგვის მოდელი ორი დამოუკიდებელი ES ხაფანგის უჯრედული ხაზის გამოყენებით, DTM096 და RRH048 (BayGenomics, CA), რომლებიც წარმოადგენენ ინტრონი 1 და Specc1l ტრანსკრიპტებს დაფიქსირებული 115-ზე (ნახ. .4A, სურათი S2).სატყუარა ვექტორის ჩანართის გენომიური მდებარეობა განისაზღვრა მთელი გენომის თანმიმდევრობით და დადასტურდა PCR-ით (ნახ. S2).გენის ხაფანგის ორივე დიზაინმა ასევე დაუშვა Specc11-lacZ რეპორტიორების ჩარჩოში შერწყმა დაჭერისას.ამიტომ, X-gal შეღებვით განსაზღვრული lacZ ექსპრესია გამოყენებული იყო Speccc11 ექსპრესიის ინდიკატორად.ორივე ალელმა აჩვენა lacZ გამოხატვის მსგავსი შაბლონები, DTM096 გენის ხაფანგი ინტრონი 1-ში აჩვენებდა უფრო ძლიერ ექსპრესიას, ვიდრე RRH048 ინტრონი 15-ში (არ არის ნაჩვენები).თუმცა, Spec1l ფართოდ არის გამოხატული, განსაკუთრებით ძლიერი გამოხატულებით ნერვულ ნაკეცებში E8.5-ზე (სურათი 4B), ნერვულ მილში და სახის პროცესებში E9.5 და E10.5 (სურათი 4C,D) და განვითარებად კიდურებში. E10-ზე.5 და თვალები (სურათი 4D).ჩვენ ადრე მოხსენებული ვიყავით, რომ SPECC1L ექსპრესია პირველ ფარინგეალურ თაღში E10.5-ზე იყო ეპითელიუმში და ფუძემდებლურ მეზენქიმა18-ში, რომელიც შეესაბამება CNCC ხაზს.SPECC1L ექსპრესიის შესამოწმებლად CNCC-ში, ჩვენ შევასრულეთ E8.5 ნერვული ნაკეცები (სურათი 4E-J) და E9.5 თავის ქალას სექციები (სურათი 4K-).E8.5-ზე, SPECC1L ინტენსიურად ღებავდა ნერვულ ნაკეცებს (ნახ. 4E, H), მათ შორის უჯრედები, რომლებიც შეღებილია NCC მარკერებით (ნახ. 4G, J).E9.5-ზე, SPECC1L (ნახ. 4K, N) ძლიერად შეღებილი მიგრირებადი CNCC ერთად შეღებილი AP2A (ნახ. 4L, M) ან SOX10 (ნახ. 4O, P).
(A) თაგვის Specc11 გენის სქემატური წარმოდგენა, რომელიც აჩვენებს მატყუარა ვექტორის ჩასმას ES DTM096 (ინტრონი 1) და RRH048 (ინტრონი 15) უჯრედის კლონებში.(BD) lacZ შეღებვა ჰეტეროზიგოტური Specc1lDTM096 ემბრიონების, რომლებიც წარმოადგენს Spec1l ექსპრესიას E8.5-დან E10.5-მდე.NE = ნეიროექტოდერმი, NF = ნერვული ნაოჭი, PA1 = პირველი ფარინგეალური თაღი.(EP) SPECC1L იმუნოშეღებვა NCC მარკერებით AP2A და SOX10 E8.5 (NF; EJ) ნერვულ ნაკეცებში და E9.5 (KP) თავის ქალას განყოფილებებში.SPECC1L შეღებვა ფართოდ დაფიქსირდა ნერვულ ნაკეცებში E8.5 (E, H; ისრისპირები), მათ შორის AP2A (F, G; ისრისპირები) და SOX10 (I, J; ისრისპირები) ეტიკეტირებული უჯრედები.E9.5-ზე, SPECC1L ძლიერად შეღებილი მიგრირებადი CNCC (K, N; ისრები) ეტიკეტირებული AP2A (L, M; ისრები) და SOX10 (O, P; ისრები).
ჰეტეროზიგოტურ Spec1lDTM096/+ და Spec1lRRH048/+ თაგვებს შორის გადაკვეთა გვიჩვენებს, რომ გენის ხაფანგის ორი ალელი ერთმანეთს არ ავსებს და რომ ნაერთი ჰეტეროზიგოტები და ემბრიონული ჰომოზიგოტები რომელიმე გენის ხაფანგის ალელისთვის ემბრიონული ლეტალურია (ცხრილი S1).მენდელის კოეფიციენტები მიუთითებდნენ დაბადებისას ჰეტეროზიგოტების გადარჩენის მაჩვენებლის შემცირებაზე (მოსალოდნელი 1.34 vs. 2.0).ჩვენ აღვნიშნეთ დაბალი პერინატალური სიკვდილიანობა ჰეტეროზიგოტებს შორის, ზოგიერთს ჰქონდა კრანიოფიალური ანომალიები (ნახ. S3).თუმცა, ამ პერინატალური კრანიოფიციალური ფენოტიპების დაბალი შეღწევადობა ართულებს მათი ძირითადი პათოფიზიოლოგიური მექანიზმების შესწავლას.ამიტომ, ჩვენ ყურადღება გავამახვილეთ ჰომოზიგოტური Specc11 მუტანტების ემბრიონულ ლეტალურ ფენოტიპზე.
ნაერთი ჰეტეროზიგოტური ან ჰომოზიგოტური Spec1lDTM096/RRH048 მუტანტის ემბრიონების უმეტესობა არ განვითარდა E9.5-10.5-ის შემდეგ (სურ. 5A-D) და ნერვული მილი არ დაიხურა წინ (ნახ. 5B, D) და ზოგჯერ დაიხურა უკან (არ არის ნაჩვენები) ..ეს კრანიალური ნერვული მილის დახურვის დეფექტი ასოცირებული იყო CNCC მარკირებული DLX2-ის უმეტესობასთან, რომელიც რჩება ნერვულ ნაკეცებში E10.5-ზე, რაც მიუთითებს დისექციაზე (სურათი 5A'-D').იმის დასადგენად, შემცირდა თუ არა CNCC-ის საერთო ზომა, ჩვენ დავაფიქსირეთ CNCC ხაზები GFP-ით ჩვენს გენის ხაფანგში Wnt1-Cre და ROSAmTmG.ჩვენ მთელი ემბრიონებიდან დაალაგეთ GFP+ NCC და GFP- (RFP+) არა-NCC.E9.5-ზე, ნაკადით დალაგებული GFP-ით მარკირებული CNCC-ების პროპორცია მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა WT-სა და მუტანტ ემბრიონებს შორის (არ არის ნაჩვენები), რაც მიუთითებს ნორმალურ CNCC სპეციფიკაციაზე.ამიტომ, ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ ნარჩენი Wnt1-Cre და DLX2 შეღებვა დაუცველ ნერვულ ნაკეცებში (სურათი 5B') გამოწვეული იყო დეფექტური CNCC შრეებით, შესაძლოა AJ უჯრედების გაზრდილი სიმკვრივის ან დისპერსიის გამო, როგორც ჩანს SPECC1L-kd უჯრედებში.ჩვენ გამოვიყენეთ NCC მარკერები SOX10, AP2A და DLX2 ნერვულ ნაკეცში CNCC-ის არსებობის დასადასტურებლად (სურათი 5E-R).E8.5-ზე, ნერვული ნაკეცების შეღებვა სამივე NCC მარკერისთვის დაფიქსირდა WT-ის (ნახ. 5E, G, I) და Spec.1l მუტანტის სექციებში (ნახ. 5F, H, J).E9.5-ზე, სანამ NCC მარკერები ღებავდნენ მიგრაციულ NCC-ს WT სექციებში (ნახ. 5M, O, Q), ნარჩენი NCC შეღებვა დაფიქსირდა Spec1l მუტანტის ემბრიონების გამოვლენილ ნერვულ ნაკეცებში (ნახ. 5N, P, R).იმის გამო, რომ SOX10 და DLX2 აღნიშნავენ მიგრაცია CNCC-ებს, ეს შედეგი ვარაუდობს, რომ SPECC1L-დეფიციტური CNCC-ები აღწევენ პოსტმიგრაციულ სპეციფიკაციას, მაგრამ ვერ ახერხებენ მიგრაციას ნერვული ნაკეცებიდან.
Specc11 დეფიციტი იწვევს ნერვული მილის დეფექტურ დახურვას, კრანიალური ნეირონული თხემის უჯრედების და AJ-ების დაშლას.
(A, B') E9.5 WT (A) ემბრიონი, რომელიც ატარებს მიგრირებადი კრანიალური ნერვული კრესტის უჯრედებს (CNCC), ეტიკეტირებული Wnt1-Cre (A').ამის საპირისპიროდ, Specc11 მუტანტის ემბრიონები აჩვენებენ ღია ნერვულ ნაკეცებს (B), ისრისპირებს და CNCC-ებს, რომლებიც არ არიან მიგრირებულნი (B', ისრისპირები).(C, D') ნათელი ველის გამოსახულებები (C, D') და იმუნოშეღებვა (C', D') CNCC მარკერის DLX2 E10.5 WT ემბრიონების (C, C') და Spec1l (D, D').WT E10.5 ემბრიონებში, DLX2-დადებითი CNCC კოლონიზაციას უწევს ღრძილების თაღებს (C', ისრები), ხოლო მუტანტებში შესამჩნევი შეღებვა გრძელდება ღია ნერვულ ნაკეცებში (D', ისრები) და პირველ ფარინგეალურ თაღებში (D', ისრები).) გარკვეული შეღებვით (ისრებით), რაც მიუთითებს CNCC-ის ცუდ დელიმინაციასა და მიგრაციაზე.ER) WT და Spec1l მუტანტური ემბრიონების სექციები E8.5 (E–L) და E9.5 (M–R) სტადიებზე იყო მარკირებული NCC მარკერებით SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) და DLX2 (I, J, Q, R).E8.5-ზე, NCC შეღებვა დაფიქსირდა ველური ტიპის ნერვულ ნაკეცში (NF) და მუტანტის მონაკვეთებში.SOX10-ისა და β-კატენინის ერთობლივი შეღებვა E8.5 WT (K) და მუტანტი (L) გამოავლინა გაზრდილი β-კატენინის შეღებვა უჯრედის საზღვრებში ნერვულ ნაკეცებში.E9.5-ზე დაფიქსირდა მიგრირებადი CNCC-ების ველური ტიპის შეღებვა (M, O, Q), ხოლო მუტანტებში, არასტრატიფიცირებული CNCC-ები ღებავდნენ ღია ნერვულ ნაკეცებს (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ მარკირების ანალიზი WT და Specc11DTM096/RRH048 ემბრიონების კორონალურ სექციებში E9.5 მუტაციით.ზედა მარჯვენა კუთხეში ნაჩვენებია სავარაუდო სექციური სიბრტყე.მუტანტური ქსოვილების მონაკვეთებში დაფიქსირდა F-აქტინის (S, T) და მიოზინის IIb (U, V) გაზრდილი შეღებვა.ნახ. 3-ში მიღებული in vitro შედეგების მსგავსად, მუტანტ ემბრიონებში, დაფიქსირდა β-კატენინის (W, X) და E-კადჰერინის (Y, Z) გაძლიერებული მემბრანის შეღებვა.(AA-BB) ველური ტიპის ემბრიონის მონაკვეთის ელექტრონულ მიკროგრაფზე, რომელიც ათვალიერებს აპიკალურ-ბაზალური უჯრედის საზღვრებს, გვიჩვენებს მკაფიო ელექტრონულ მკვრივ რეგიონს, რომელიც მიუთითებს წებოვან შეერთებაზე (AA, ისრები).ამის საპირისპიროდ, Specc11 მუტანტური ემბრიონების სექციებში (BB, ისრები), მთელი აპიკობაზალური შეერთება არის ელექტრონის სიმკვრივე, რაც მიუთითებს წებოვანი შეერთების გაზრდილ სიმკვრივესა და დისპერსიაზე.
ჩვენი ჰიპოთეზის შესამოწმებლად, რომ შემცირებული შრეები განპირობებულია შეცვლილი AJ-ით, ჩვენ გამოვიკვლიეთ AJ მარკირება Specc1l მუტანტის ემბრიონების გამოვლენილ ნერვულ ნაკეცებში (ნახ. 5S-Z).ჩვენ დავაფიქსირეთ აქტინის სტრესის ბოჭკოების ზრდა (ნახ. 5S, T) და მიოზინის IIB შეღებვის ერთდროული გაზრდილი ლოკალიზაცია აქტინის ბოჭკოებზე (ნახ. 5U, V).მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ შევნიშნეთ β-კატენინის (ნახ. 5W,X) და E-კადჰერინის (ნახ. 5Y,Z) გაზრდილი შეღებვა უჯრედშორის საზღვრებზე.ჩვენ ასევე გამოვიკვლიეთ NCC-ის β-კატენინის შეღებვა E8.5 ემბრიონის ნერვულ ნაკეცებში (ნახ. 5K, L).β-კატენინის შეღებვა უფრო ძლიერი იყო Specc1l მუტანტის ნერვულ ნაკეცებში (ნახ. 5L და K), რაც ვარაუდობს, რომ AJ ცვლილებები დაიწყო.E9.5 ემბრიონების თავის ქალას სექციების ელექტრონულ მიკროგრაფებში ჩვენ კვლავ დავაფიქსირეთ გაზრდილი დიფუზური ელექტრონ-მკვრივი შეღებვა Spec1l მუტანტის ემბრიონებში WT-თან შედარებით (ნახ. 5AA, BB და S1E-H).ერთად აღებული, ეს შედეგები მხარს უჭერს ჩვენს in vitro შედეგებს SPECC1L-kd U2OS უჯრედებში და ვარაუდობს, რომ AJ-ის შეღებვა წინ უძღვის CNCC სტრატიფიკაციას ჩვენს მუტანტ ემბრიონებში.
AKT აქტივობასა და E-კადჰერინის სტაბილურობას შორის ცნობილი ანტაგონისტური კავშირის გათვალისწინებით, 17,28 ჩვენ ვარაუდობთ PI3K-AKT სიგნალიზაციის ჩართვაზე.გარდა ამისა, ჩვენ დავაფიქსირეთ სუბეპიდერმული ბუშტუკები ჩვენს ზოგიერთ მუტანტ ემბრიონში, რომელიც გადაურჩა ლეტალობას (<5%) E9.5-10.5-ზე და ნაცვლად დამკვიდრდა დაახლოებით E13.5-ზე (ნახ. S3).სუბედერმული ვეზიკულები არის შემცირებული PI3K-AKT სიგნალიზაციის დამახასიათებელი ნიშანი PDGFRα12-ზე დაფუძნებული.Fantauzzo და სხვ.(2014) იტყობინება, რომ PDGFRα-ზე დაფუძნებული PI3K აქტივაციის დარღვევა PdgfraPI3K/PI3K მუტანტ ემბრიონებში იწვევს სუბეპიდერმულ ვეზიკულებს, ნერვული მილის დეფექტებს და სასის ნაპრალის ფენოტიპებს.მართლაც, პან-AKT და აქტიური ფოსფორილირებული Ser473-AKT დონე შემცირდა in vivo Spec1l მუტანტის ქსოვილებში E9.5 ემბრიონულ გაჩერებამდე (ნახ. 6A-D).ფოსფორილირებული Ser473-AKT-ის დონის დაქვეითება შეიძლება მთლიანად განპირობებული იყოს პან-AKT-ის დონის შემცირებით in vivo (სურათი 6E) და in vitro (სურათი 6F).ინ ვიტრო კლება დაფიქსირდა მხოლოდ მაშინ, როდესაც U2OS უჯრედები ძლიერ შერწყმული იყო უჯრედის ფორმისა და AJ სიმკვრივის ცვლილებებთან (სურათი 6D).ამრიგად, ჩვენი მონაცემები ვარაუდობს, რომ SPECC1L არის PI3K-AKT სიგნალიზაციის ახალი დადებითი რეგულატორი კრანიოფიალურ მორფოგენეზში.
(A–E) E8.5 (A,B) და E9.5 (C,D) თავის ქალას სექციები ან E9.5 ლიზატები Specc1l მუტანტის ემბრიონებიდან (E), რომლებიც აჩვენებს აქტიური ფოსფორილირებული S473-AKT და პან-AKT პროტეინის შემცირებას , საკონტროლო WT-თან შედარებით.Western blotting ჩატარდა ველური ტიპის ლიზატებზე და მუტანტ ლიზატებზე იმავე პირობებში.SPECC1L-სთვის ნაჩვენები სურათები აღებულია ერთი ბლოტიდან.იგივე ბლატი ამოიღეს და ხელახლა გამოიკვლიეს ანტი-პან-ACT და β-აქტინის ანტისხეულებით.პან-AKT დონეები E8.5 ნერვულ ნაკეცებში (A, B) და ფოსფორილირებული S473-AKT დონე E9.5 თავის ქალას მონაკვეთებში მნიშვნელოვნად შემცირდა.(F) Pan-AKT დონეები ანალოგიურად შემცირდა SPECC1L-kd U2OS უჯრედების ლიზატებში, რომლებიც აღებული იყო მაღალი შერწყმის დროს.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს SEM-ებს სამი დამოუკიდებელი Western blot რაოდენობიდან.(GJ) WT ემბრიონების სექციები E9.5-ზე შეღებილი KI67 და გატეხილი კასპაზა 3, შესაბამისად, აჩვენებს უჯრედების პროლიფერაციას (G, G') და მცირე აპოპტოზურ აქტივობას (H, H').Specc11 მუტანტის ემბრიონები აჩვენებენ შესადარებელ უჯრედულ პროლიფერაციას (I), მაგრამ უჯრედების რაოდენობა, რომლებიც განიცდიან აპოპტოზს, მნიშვნელოვნად გაიზარდა (J).
შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ პროლიფერაციისა და აპოპტოზის მარკერები.ჩვენ არ დავაფიქსირეთ რაიმე განსხვავება E9.5 ემბრიონის პროლიფერაციაში (ნახ. 6E, G I-თან შედარებით) პროლიფერაციის ინდექსით 82.5% WT მუტანტებისთვის და 86.5% Spec1l მუტანტებისთვის, გაზომილი KI67 შეღებვით (p <0.56, Fisher's. ზუსტი ტესტი).ანალოგიურად, ჩვენ არ დავაფიქსირეთ რაიმე განსხვავება აპოპტოზში, რომელიც გაზომილი იყო დაშლილი კასპაზა 3-ის შეღებვით ნერვულ ნაკეცებში E8.5-ზე ემბრიონის გაჩერებამდე (არ არის ნაჩვენები) (არ არის ნაჩვენები).ამის საპირისპიროდ, აპოპტოზი მნიშვნელოვნად გაიზარდა ყველა E9.5 მუტანტის ემბრიონში (ნახ. 6F, H და J).აპოპტოზის ეს საერთო ზრდა შეესაბამება შემცირებულ PI3K-AKT სიგნალიზაციას და ადრეულ ემბრიონულ ლეტალობას29,30,31.
შემდეგი, PI3K-AKT სიგნალიზაციის მიზეზობრივი როლის დასადასტურებლად ჩვენს kd უჯრედებში AJ ცვლილებებში, ჩვენ ქიმიურად შევცვალეთ გზა საკონტროლო და kd უჯრედებში (სურათი 7A-F).ჩვენ გამოვიყენეთ როგორც მარკერი უჯრედის ფორმის ცვლილების ფენოტიპი, რომელიც შეინიშნებოდა შერწყმულ SPECC1L-kd უჯრედებში, რომელიც რაოდენობრივად დავადგინეთ ყველაზე გრძელი განზომილების (სიგრძის) შესაბამის ვერტიკალურ განზომილებას (სიგანეს) შეფარდების გამოყენებით.შედარებით მრგვალი ან კუბოიდური უჯრედებისთვის მოსალოდნელია 1 თანაფარდობა (სურათი 7G).გარდა უჯრედის ფორმისა, ჩვენ ასევე დავადასტურეთ ეფექტი AJ-ზე β-კატენინის შეღებვით (ნახ. 7A'-F').PI3K-AKT გზის დათრგუნვა ვორტმანინის გამოყენებით საკმარისი იყო უჯრედის ფორმის შესაცვლელად საკონტროლო უჯრედებში (სურათი 7A,C) და AJ (სურათი 7A').PI3K-AKT აქტივატორი SC-79 არ იმოქმედა უჯრედის ფორმაზე (სურათი 7A, E) ან AJ გაფართოებაზე (სურათი 7A') საკონტროლო უჯრედებში.SPECC1L-kd უჯრედებში, PI3K-AKT გზის შემდგომმა ჩახშობამ გამოიწვია აპოპტოზის გაზრდა (ნახ. 7B,D) და β-კატენინის შეღებვის შესამჩნევი ზრდა (ნახ. 7B'), რომელიც შეესაბამება ჩვენს in vivo მძიმე მუტანტებს.მნიშვნელოვანია, რომ PI3K-AKT გზის გააქტიურებამ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა უჯრედის ფორმა (სურათი 7B,F) და AJ ფენოტიპები (სურათი 7B”).უჯრედის ფორმის ცვლილებები რაოდენობრივად შეფასდა, როგორც უჯრედის სიმრგვალების თანაფარდობა (CCR) და შედარება მნიშვნელოვნებისთვის, როგორც ზემოთ აღწერილია (ნახ. 7G).მართლაც, საკონტროლო უჯრედებში (ნახ. 7G, CCR = 1.56), ვორტმანინით მკურნალობა საკმარისი იყო უჯრედის ფორმის საგრძნობლად შესაცვლელად (ნახ. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) დაფიქსირებულის მსგავსი მასშტაბით. SPECC1L-ში.-kd უჯრედები (ნახ. 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd უჯრედების ვორტმანინით მკურნალობა (ნახ. 7G, CCR = 3.60, უმნიშვნელო) არ იყო უფრო მნიშვნელოვანი, ვიდრე არანამკურნალევი kd უჯრედები (ნახ. 7G, CCR = 3.46, უმნიშვნელო) ან ვორტმანინით დამუშავებული საკონტროლო უჯრედები (ნახ. 7G)., CCR = 3.46, უმნიშვნელო) დამატებით გავლენას ახდენს უჯრედის გახანგრძლივებაზე (7G, CCR = 3.61, უმნიშვნელო).რაც მთავარია, SC-79 AKT აქტივატორმა აღადგინა SPECC1L-kd უჯრედების წაგრძელებული ფენოტიპი (ნახ. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).ეს შედეგები ადასტურებს, რომ SPECC1L არეგულირებს PI3K-AKT სიგნალიზაციას და ვარაუდობს, რომ SPECC1L-ის ზომიერი შემცირება გავლენას ახდენს უჯრედების ადჰეზიაზე, ხოლო ძლიერი შემცირება იწვევს აპოპტოზს (ნახ. 8).
(A–F') საკონტროლო (A, C, E) და SPECC1L-kd (B, D, F) უჯრედები დამუშავებული PI3K-AKT გზის ინჰიბიტორით ვორტმანინი (C, D) ან SC-79 აქტივატორი (E, F) მკურნალობა დაუმუშავებელი საკონტროლო უჯრედები არის კუბოიდური (A) ნორმალური β-კატის უჯრედული შეღებვით (A'), ხოლო kd უჯრედები წაგრძელებულია (B) გაზრდილი β-კატის შეღებვით (B').PI3K-AKT გზის ჩახშობის შემდეგ, საკონტროლო უჯრედები გახანგრძლივდა (C) β-კატის გაფართოებით (C'), ხოლო kd უჯრედებმა დაიწყეს აპოპტოზის (D) გავლა, ჩვენი მაღალი მუტაციური ემბრიონების მსგავსი და აჩვენებს უკიდურესად გაძლიერებულ β-კატას.შეღებვა (D').PI3K-AKT გზის გააქტიურების შემდეგ, საკონტროლო უჯრედები დარჩა კუბოიდური (E) და ჰქონდათ ნორმალური β-კატის (E') შეღებვა, ხოლო kd უჯრედებმა აჩვენეს მნიშვნელოვნად გაუმჯობესებული უჯრედის ფორმა (F) და β-კატის (F') შეღებვა, რაც მიუთითებს (G) უჯრედის ფორმის ცვლილების ხარისხი (AF) რაოდენობრივად შეფასდა უჯრედის სიმრგვალების თანაფარდობის (CCR) ყველაზე გრძელი განზომილების (სიგრძის) და შესაბამისი ვერტიკალური განზომილების (სიგანის) გამოყენებით MetaMorph პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.დაუმუშავებელი (NT) SPECC1L-kd უჯრედები (CCR = 3.46) მნიშვნელოვნად გრძელი იყო ვიდრე საკონტროლო უჯრედები (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).საკონტროლო უჯრედებში PI3K-AKT გზის ვორტის დათრგუნვა საკმარისი იყო უჯრედის ფორმის მსგავსი დრეკადობის გამოწვევისთვის (CCR=3.61, p<2.4×10-9).ანალოგიურად, AKT აქტივაციამ SC-79-ით SPECC1L-kd უჯრედებში აღადგინა უჯრედის დრეკადობა საკონტროლო დონემდე (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd უჯრედების ვორტმანინით მკურნალობამ გამოიწვია გაზრდილი აპოპტოზი, მაგრამ არა შემდგომი ზრდა უჯრედის ფორმის ცვლილებაში (CCR=3.60) არანამკურნალევ kd-თან (CCR=3.46, ns) ან ვორტმანინით დამუშავებულ საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით (3.61), რომელიც დაფიქსირდა.ns = არ აქვს მნიშვნელობა.+/- SEM გაზომვები 50 უჯრედისთვის ნაჩვენებია.სტატისტიკური განსხვავებები გამოითვალა სტუდენტის t-ტესტის გამოყენებით.
(A) PI3K-AKT გზის დათრგუნვისა და გააქტიურების სქემატური წარმოდგენა, რაც იწვევს AJ ცვლილებების და გადარჩენას, შესაბამისად.(B) შემოთავაზებული მოდელი AKT ცილის სტაბილიზაციისთვის SPECC1L-ით.
პრემიგრაციული CNCC-ები საჭიროებენ AJ ლიზისს წინა ნერვული ნაოჭის ნეიროეპითელური უჯრედებისგან გამოსაყოფად1,15,32.AJ კომპონენტების გაზრდილი შეღებვა და აპიკალურ-ბაზალური AJ ასიმეტრიული განაწილების დაკარგვა SPECC1L-დეფიციტური უჯრედებში, როგორც in vitro, ასევე in vivo, SPECC1L-ის ფიზიკურ სიახლოვეს β-კატენინთან ერთად, ვარაუდობს, რომ SPECC1L ფუნქციონირებს AJ-ის ლოკალური სტაბილურობის სათანადოდ შესანარჩუნებლად. ორგანიზაციის კუნთები.აქტინის ციტოჩონჩხი.SPECC1L-ის კავშირი აქტინის ციტოჩონჩხთან და β-კატენინთან და შედედებული აქტინის ძაფების რაოდენობის ზრდა SPECC1L-ის არარსებობის შემთხვევაში შეესაბამება AJ სიმკვრივის დაკვირვებულ ზრდას.კიდევ ერთი შესაძლებლობა არის ის, რომ აქტინის ბოჭკოების გაზრდილი რაოდენობა SPECC1L-დეფიციტურ უჯრედებში იწვევს უჯრედშორისი დაძაბულობის ცვლილებას.იმის გამო, რომ ფიჭური სტრესი გავლენას ახდენს AJ 33 დინამიკაზე, ძაბვის ცვლილებებმა შეიძლება გამოიწვიოს უფრო დიფუზური AJ 34.ასე რომ, ნებისმიერი ცვლილება გავლენას მოახდენს CNCC ფენებზე.
Wnt1 გამოხატულია ადრეულ ნერვულ ნაკეცებში, რომლებიც წარმოქმნიან ნერვულ ქერქის უჯრედებს.ამრიგად, Wnt1-cre ხაზის მიკვლევა აღნიშნავს NCC35-მდე და მიგრაციას.თუმცა, Wnt1 ასევე აღნიშნავს ტვინის დორსალური ქსოვილის კლონებს, რომლებიც ასევე წარმოიქმნება ადრეული ნერვული ნაკეცებიდან 35,36, რაც სავარაუდოს იძლევა, რომ ჩვენი შეღებვა E9.5 მუტანტების Wnt1 მარკერებისთვის ღია ნერვულ ნაკეცებში არ არის CNCC.ჩვენმა დადებითმა შეღებვამ NCC მარკერებისთვის AP2A და SOX10 დაადასტურა, რომ Speccc11 მუტანტის ემბრიონის გამოვლენილი ნერვული ნაკეცები ნამდვილად შეიცავდა CNCC-ს.გარდა ამისა, ვინაიდან AP2A და SOX10 არის ადრეული მიგრირებადი NCC-ის მარკერები, დადებითი შეღებვა მიუთითებს იმაზე, რომ ეს უჯრედები არის პოსტმიგრაციული CNCC, რომელთა სტრატიფიცირება შეუძლებელია E9.5-ით.
ჩვენი მონაცემები ვარაუდობს, რომ AJ-ის მოლეკულური რეგულირება SPECC1L-ით შუამავლობს PI3K-AKT სიგნალიზაციას.AKT სიგნალიზაცია მცირდება SPECC1L დეფიციტურ უჯრედებსა და ქსოვილებში.დასკვნები Fantauzzo et al.მხარს უჭერს PI3K-AKT სიგნალის პირდაპირ როლს კრანიოფიალურ მორფოგენეზში.(2014) აჩვენა, რომ PDGFRα-ზე დაფუძნებული PI3K-AKT სიგნალიზაციის არარსებობა იწვევს სასის ნაპრალის ფენოტიპს.ჩვენ ასევე ვაჩვენებთ, რომ PI3K-AKT გზის დათრგუნვა საკმარისია AJ და უჯრედის ფორმის შესაცვლელად U2OS უჯრედებში.ჩვენი დასკვნების შესაბამისად, კაინი და სხვ.37 აჩვენა, რომ PI3K α110 ქვედანაყოფის დაქვეითება ენდოთელიალურ უჯრედებში იწვევს პერიუჯრედულ β-კატენინის შეღებვის ანალოგიურ ზრდას, რომელსაც მოიხსენიებენ, როგორც "დაკავშირების ინდექსის" ზრდას.თუმცა, ენდოთელიალურ უჯრედებში, რომელთა აქტინის ძაფები უკვე ძალიან ორგანიზებულია, PI3K-AKT გზის დათრგუნვა იწვევს უჯრედის ფხვიერ ფორმას.ამის საპირისპიროდ, SPECC1L-kd U2OS უჯრედებმა აჩვენეს მოგრძო უჯრედის ფორმა.ეს განსხვავება შეიძლება იყოს უჯრედის ტიპის სპეციფიკური.მიუხედავად იმისა, რომ PI3K-AKT სიგნალის ჩახშობა მუდმივად მოქმედებს აქტინის ციტოჩონჩხზე, ეფექტი უჯრედის ფორმაზე განისაზღვრება დაძაბულობის ცვლილებებით, რომელიც გამოწვეულია ცენტრალური აქტინის ბოჭკოების სიმკვრივისა და ორგანიზაციის ცვლილებებით.U2OS უჯრედებში ჩვენ ვიყენებდით მხოლოდ უჯრედის ფორმის ცვლილებებს, როგორც SPECC1L-დეფიციტური AJ ცვლილებისა და აღდგენის მარკერი.დასასრულს, ჩვენ ვარაუდობთ, რომ AKT გზის დათრგუნვა SPECC1L დეფიციტში ზრდის AJ სტაბილურობას და ამცირებს დელამინაციას CNCC-ში.
საინტერესოა, რომ პან-AKT დონეები შემცირდა in vitro და in vivo გარდა ფოსფორილირებული 473-AKT დონის SPECC1L-ის არარსებობის შემთხვევაში, რაც მიუთითებს PI3K-AKT სიგნალიზაციის რეგულირებაზე AKT ცილის სტაბილურობის ან ბრუნვის დონეზე.SPECC1L და MID1 გენები, ორივე ასოცირებული Opitz/GBBB სინდრომთან, კოდირებს ცილებს, რომლებიც ასტაბილურებენ მიკროტუბულებს 18,22.მექანიზმი, რომლითაც SPECC1L და MID1 შუამავლობენ მიკროტუბულების სტაბილიზაციას, ბოლომდე არ არის გასაგები.SPECC1L-ის შემთხვევაში, ეს სტაბილიზაცია მოიცავს მიკროტუბულების ქვეჯგუფის გაძლიერებულ აცეტილაციას 18 .შესაძლებელია, რომ SPECC1L იყენებს მსგავს მექანიზმს სხვა ცილების სტაბილიზაციისთვის, როგორიცაა AKT.ნაჩვენებია, რომ ლიზინის ნარჩენების აცეტილაცია AKT ცილაში იწვევს მემბრანის ლოკალიზაციის და ფოსფორილირების შემცირებას38.გარდა ამისა, K63 ჯაჭვის უბიკვიტინაცია იმავე ლიზინის ნარჩენზე AKT-ზე საჭიროა მისი მემბრანის ლოკალიზაციისა და აქტივაციისთვის39,40.SPECC1L პროტეინებთან ურთიერთქმედების რამდენიმე ფაქტორს შორის, რომლებიც იდენტიფიცირებულია სხვადასხვა მაღალი გამტარუნარიანობის საფუარის ორ ჰიბრიდულ ეკრანებზე, ოთხი - CCDC841, ECM2942, APC და UBE2I43 - ჩართული იყო ცილის ბრუნვაში ან სტაბილურობაში უბიკვიტინაციის ან სუმოილირების გზით.SPECC1L შეიძლება ჩართული იყოს AKT ლიზინის ნარჩენების პოსტტრანსლაციურ მოდიფიკაციაში, რაც გავლენას ახდენს AKT სტაბილურობაზე.თუმცა, SPECC1L-ის კრიტიკული როლი AKT ცილის ლოკალიზაციასა და სტაბილურობაში რჩება გასარკვევი.
SPECC1L ექსპრესიის მძიმე დეფექტებმა in vivo გამოიწვია AJ მარკერის შეღებვისა და დეფექტური CNCC გადაფარვის, ასევე გაზრდილი აპოპტოზის და ადრეული ემბრიონის ლეტალურობის გაზრდა.წინა მოხსენებებმა აჩვენა, რომ თაგვების მუტანტები აპოპტოზის გაზრდილი დონეებით დაკავშირებულია ნერვული მილის დეფექტებთან 44,45,46,47 და კრანიოფიალურ დეფექტებთან48.ვარაუდობენ, რომ უჯრედების გადაჭარბებულმა სიკვდილმა ნერვულ ნაკეცებში ან ფარინგეალური თაღები შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედების არასაკმარისი რაოდენობა, რომელიც საჭიროა სწორი მორფოგენეტიკური მოძრაობისთვის 48,49,50.ამის საპირისპიროდ, ჩვენი SPECC1L დეფიციტური უჯრედული ხაზები ზომიერად შემცირებული SPECC1L ექსპრესიით აჩვენებდნენ მხოლოდ AJ ცვლილებებს უჯრედების სიკვდილის გაზრდის მტკიცებულების გარეშე.თუმცა, PI3K-AKT გზის ქიმიურმა ინჰიბირებამ ამ Kd უჯრედებში გამოიწვია აპოპტოზის გაზრდა.ამრიგად, SPECC1L გამოხატვის ან ფუნქციის ზომიერი შემცირება უზრუნველყოფს უჯრედების გადარჩენას.ეს შეესაბამება დაკვირვებას, რომ იშვიათი Specc11 მუტანტის ემბრიონები, რომლებიც გაურბიან დაპატიმრებას ქ.E9.5 - შესაძლოა გენის დაჭერის შემცირებული ეფექტურობის გამო - შეუძლია დახუროს მათი ნერვული მილები და შეაჩეროს განვითარება მოგვიანებით, ხშირად კრანიოფიალური დეფექტებით (ნახ. S3).ამას ასევე შეესაბამება ჰეტეროზიგოტური Spec1l ემბრიონების იშვიათი შემთხვევა კრანიოფიალური ანომალიებით - ალბათ გენის დაჭერის გაზრდილი ეფექტურობის გამო - ისევე როგორც აღმოჩენა ზებრათევში, რომელშიც SPECC1L ორი ორთოლოგიდან ერთ-ერთი (specc1lb) იწვევს გვიან ემბრიონულ ფენოტიპებს. ქვედა ყბა და ორმხრივი ნაპრალები51.ამრიგად, ადამიანის პაციენტებში გამოვლენილმა ჰეტეროზიგოტურმა SPECC1L ფუნქციის დაკარგვის მუტაციებმა შეიძლება გამოიწვიოს SPECC1L ფუნქციის მცირე დარღვევები კრანიოფიალური მორფოგენეზის დროს, რაც საკმარისია მათი პირსახის ნაპრალების ასახსნელად.SPECC1L-ზე დაფუძნებული უჯრედშორისი კონტაქტების რეგულირება ასევე შეიძლება შეასრულოს როლი პალატოგენეზსა და ფარინგეალური თაღების შერწყმაში.SPECC1L ფუნქციის შემდგომი კვლევები ხელს შეუწყობს დროებითი უჯრედშორისი კონტაქტების როლის გარკვევას CNCC-ში ნერვული მილის დახურვის დროს ნეიროეპითელური უჯრედების მოძრაობასა და კრანიოფიალურ მორფოგენეზში.
U2OS ოსტეოსარკომის კონტროლი და SPECC1L-kd უჯრედები ადრე იყო აღწერილი (Saadi et al., 2011).ანტისხეულები SPECC1L-ის წინააღმდეგ ასევე ადრე იყო დახასიათებული (Saadi et al., 2011).ანტი-β-კატენინის ანტისხეულები (კურდღელი; 1:1000; სანტა კრუზი, დალასი, TX) (თაგვი; 1:1000; უჯრედული სიგნალიზაციის ტექნოლოგია, Danvers, MA), მიოზინი IIb (1:1000; სიგმა-ოლდრიჩი, სენტ ლუისი ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, სან დიეგო , კალიფორნია), DLX2 (1:1000; Abcam, კემბრიჯი, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; უჯრედის სიგნალიზაციის ტექნოლოგია, დანვერსი, MA), დაშლილი კასპაზა 3 (1:1000; უჯრედის სიგნალიზაციის ტექნოლოგია, Danvers, MA) და β-აქტინი (1:2500; სიგმა-ოლდრიჩი, სენტ ლუისი, MO ) გამოიყენებოდა როგორც აღწერილია..აქტინის ძაფები შეღებილი იყო Acti- stain როდამინის ფალოიდინით (ციტოჩონჩხი, დენვერი, კოლორადო).
U2OS საკონტროლო უჯრედები და SPECC1L-kd უჯრედები კულტივირებული იყო სტანდარტული მაღალი გლუკოზის DMEM-ში, რომელსაც დაემატა 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ ცვლილებებისთვის, 2 x 105 უჯრედი დათესეს 0.1% ღორის ჟელატინით დამუშავებულ მინაზე (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) და დაფიქსირდა უჯრედის ფორმის ცვლილებები.უჯრედები შეგროვდა სხვადასხვა მითითებულ დროში: დათესვიდან 4 საათის შემდეგ (t = 1), დათესვიდან 24 საათის შემდეგ (t = 2), შერწყმა უჯრედის ფორმის შეცვლის გარეშე (t = 3), უჯრედის ფორმის ცვლილება (t = 4) , უჯრედის ფორმის შეცვლიდან 24 სთ (t = 5) და 48 სთ უჯრედის ფორმის შეცვლიდან (t = 6) (ნახ. 1, 2, 3).PI3K-AKT გზის მოდულაციისთვის, უჯრედები კულტივირებული იყო მითითებულ კონცენტრაციებზე PI3K-AKT ინჰიბიტორი ვორტმანინით (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ან SC-79 აქტივატორი (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).ქიმიკატების შემცველი გარემო ყოველდღიურად იცვლებოდა.
კადრ-კადრის ჩანაწერები გაკეთდა ცოცხალ კონტროლზე და KD უჯრედებზე ნორმალური კულტურის პირობებში და ფაზის კონტრასტის სურათები გროვდებოდა ყოველ 10 წუთში 7 დღის განმავლობაში.სურათები იქნა მიღებული კომპიუტერით კონტროლირებადი Leica DM IRB ინვერსიული მიკროსკოპის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია მექანიკური საფეხურით და 10 × N-PLAN ობიექტივით, რომელიც დაკავშირებულია QImaging Retiga-SRV კამერასთან.ვიზუალიზაციის დროს უჯრედული კულტურები შენარჩუნებული იყო 37°C ტემპერატურაზე ტენიან ატმოსფეროში 5% CO2-ით.
ორი გენის ხაფანგის ES უჯრედული ხაზი DTM096 და RRH048 რეგიონალური მუტანტის თაგვის რესურს ცენტრიდან (UC Davis, CA) გამოყენებული იქნა Specc11 დეფიციტური თაგვის ხაზების გენერირებისთვის, დანიშნული Specc1lgtDTM096 და Spec1lgtRRH046.მოკლედ, 129/REJ ES უჯრედები შეყვანილი იქნა C57BL6 ბლასტოცისტებში.შედეგად მიღებული ქიმერული მამრი თაგვები გამოყვანილი იქნა მდედრობითი სქესის თაგვებთან ერთად, რათა ამოიცნონ შთამომავლობა აგუტის საფარის შეფერილობით.გენის ხაფანგის ვექტორის ჩანართების არსებობა გამოიყენებოდა ჰეტეროზიგოტების იდენტიფიცირებისთვის.თაგვები ინახებოდა შერეულ ფონზე 129/REJ;C57BL6.გენეტიკური ხაფანგის ვექტორის ჩასმის ადგილის მდებარეობა დადასტურებული იყო RT-PCR-ით, გენომის თანმიმდევრობით და გენეტიკური კომპლემენტაციით (დამატებითი სურათი 1).ორმაგი ჰეტეროზიგოტური Specc1lGT თაგვების CNCC შტოს დასადგენად, ROSAmTmG (#007576) და Wnt1-Cre (#003829) თაგვები (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) გადაკვეთეს ROSAmTmG და WntTmG და WntTmG incccC-ის წარმოებისთვის.თაგვებზე ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა კანზასის უნივერსიტეტის სამედიცინო ცენტრის ინსტიტუციური ცხოველთა მოვლისა და გამოყენების კომიტეტის მიერ დამტკიცებული პროტოკოლების მიხედვით.
ემბრიონები დაფიქსირდა (1% ფორმალდეჰიდი, 0.2% გლუტარალდეჰიდი, 2 მმ MgCl2, 0.02% NP-40, 5 მმ EGTA) 60 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.X-gal შეღებვის ხსნარში ფიქსაციის შემდეგ (5 მმ კალიუმის ფეროციანიდი, 5 მმ კალიუმის ფეროციანიდი, 2 მმ MgCl2, 0.01% ნატრიუმის დეოქსიქოლატი, 0.02% NP-40, 1 მგ/მლ X-gal) შეღებვის განვითარება განხორციელდა 37°C-ზე. .°C 1-6 საათის განმავლობაში.ემბრიონები დაფიქსირდა 4% PFA-ში და ვიზუალიზაცია მოხდა.
Western blotting-ისთვის უჯრედები ლიზირებული იყო პასიურ ლიზისის ბუფერში (Promega, Fitchburg, WI) დამატებული HALT პროტეაზას ინჰიბიტორების ნარევით (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).ლიზატები დამუშავდა 12%-იან პოლიაკრილამიდის Mini-PROTEAN TGX მზა გელებზე (Bio-Rad, Hercules, CA) და გადატანილი იქნა Immobilon PVDF გარსებზე (EMD Millipore, Billerica, MA).გარსები დაბლოკილია 5% რძეში PBS-ში, რომელიც შეიცავს 0.1% Tween-ს.ანტისხეულები ინკუბირებული იყო ღამით 4°C ტემპერატურაზე ან ერთი საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.Femto SuperSignal West ECL რეაგენტი (Thermo Scientific, Waltham, MA) გამოიყენებოდა სიგნალის გენერირებისთვის.იმუნოშეღებვისთვის, ემბრიონები დაფიქსირდა ღამით 4% PFA/PBS-ში და კრიოკონსერვირებული.ქსოვილის კრიოსექცია დაიბლოკა PBS-ში, რომელიც შეიცავს 1% თხის ნორმალურ შრატს (Thermo Scientific, Waltham, MA) და 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) და შემდეგ ინკუბირებული იყო 4°C-ზე ინკუბატორში ღამე.ანტისხეულებით და ფლუორესცენტური მეორადი ანტისხეულებით (1:1000) 1 საათის განმავლობაში 4°C-ზე.შეღებილი სექციები მოთავსდა ProLong ოქროს გარემოში (Thermo Scientific, Waltham MA) და ბრტყელი სურათები მიიღეს Leica TCS SPE კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით.თითოეული იმუნოშეღებვა ჩატარდა, როგორც სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი მინიმუმ ორი მუტანტის ემბრიონის ციროსექციაზე.ნაჩვენებია წარმომადგენლობითი ექსპერიმენტი.
უჯრედები ინკუბირებული იყო მოდიფიცირებულ RIPA ბუფერში (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% გლიცეროლი, 2 mM EDTA და HALT პროტეაზას ინჰიბიტორი (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) მოკლედ, ლიზატები წინასწარ გაიწმინდა პროტეინის G მაგნიტური მარცვლებით (Life Technologies, Carlsbad, CA) და შემდეგ ინკუბირებული იყო ღამით 4°C-ზე. ანტი-SPECC1L ან IgG პროტეინის G პროტეინის მარცვლები გამოიყენეს SPECC1L-ის ამოსაღებად და ჩატარდა Western blotting ანტი-ს გამოყენებით. ზემოთ აღწერილი -β-კატენინის ანტისხეული ნაჩვენები co-IP ექსპერიმენტები წარმოადგენს ოთხი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტის წარმომადგენელს.
ფიქსირებული კულტივირებული უჯრედები ან თაგვის ემბრიონული ქსოვილები მიეწოდება ელექტრონულ მიკროსკოპის ცენტრს კანზას უნივერსიტეტის სამედიცინო ცენტრში.მოკლედ, ნიმუშები ჩაშენებული იქნა EMbed 812 ფისში (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), პოლიმერიზებული იყო ღამით 60°C-ზე და 80 ნმ-ზე კვეთა Leica UC7 ულტრამიკროტომის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო ალმასის პირით.სექციების ვიზუალიზაცია მოხდა JEOL JEM-1400 გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო 100 კვ Lab6 იარაღით.
როგორ მოვიყვანოთ ეს სტატია: Wilson, NR et al.SPECC1L-ის დეფიციტი იწვევს შელესილი სახსრების სტაბილურობის გაზრდას და კრანიალური ნეირონული ქედის უჯრედების დელამინაციის შემცირებას.მეცნიერება.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.ნერვული ქედის ინდუქცია და დიფერენციაცია.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
კორდერო, DR და სხვ.კრანიალური ნერვული ქედის უჯრედები მოძრაობაში: მათი როლი კრანიოფიალურ განვითარებაში.სამედიცინო გენეტიკის ამერიკული ჟურნალი.ნაწილი A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
ბოლანდი, RP ნეიროკრისტოპათია: მისი ზრდა და განვითარება 20 წლის განმავლობაში.პედიატრი.პათოლოგია.ლაბორატორია.წამალი.17, 1–25 (1997).
მანგოლდ ე., ლუდვიგ კუ და ნოტენ MM გარღვევა პირსახის ნაპრალების გენეტიკაში.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. and Riley, FM კრანიალური ნერვული ქედის უჯრედების მიგრაციისა და ნიმუშის მოლეკულური მექანიზმები კრანიოფიალური განვითარების დროს.განვითარების 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH და Murray, JK ტუჩისა და სასის ნაპრალი: გენეტიკური და გარემოს გავლენის გაგება.ბუნებრივი კომენტარი.გენეტიკა 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
ინგრამი, CR და სხვ.კანის, კიდურების და კრანიოფიალური რეგიონის პათოლოგიური მორფოგენეზი ინტერფერონის მარეგულირებელი ფაქტორი-6 (Irf6)-დეფიციტური თაგვებში.ეროვნული გენეტი.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3-ის დომინანტური მუტაციები იწვევს ვან დერ ვაორდის სინდრომს და აფერხებს პირის ღრუს პერიდერმის განვითარებას.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ და Juriloff, DM განაახლეთ თაგვის მუტანტების სია ნერვული მილის დახურვის დეფექტებით და პროგრესი ნერვული მილის დახურვის სრული გენეტიკური გაგებისკენ.დაბადების დეფექტების გამოკვლევა.ნაწილი A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K შუამავლობით PDGFRalpha სიგნალიზაცია არეგულირებს გადარჩენას და პროლიფერაციას ჩონჩხის განვითარებაში p53-დამოკიდებული უჯრედშიდა გზის მეშვეობით.გენის განვითარება 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND და Murdoch, JN Disheveled: კონვერგენტული გაფართოების კავშირი ნერვული მილის დახურვასთან.ტენდენციები ნევროლოგიაში.26, 453–455, დოი: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).