304 უჟანგავი ფოლადის ხვეული მილის ქიმიური კომპონენტი, SPACA6 ექტოდდომინის სტრუქტურა შეიცავს ცილების კონსერვაციას, რომელიც დაკავშირებულია გამეტების შერწყმასთან.

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
სლაიდერები, რომლებიც აჩვენებს სამ სტატიას თითო სლაიდზე.გამოიყენეთ უკანა და შემდეგი ღილაკები სლაიდებში გადასაადგილებლად, ან სლაიდის კონტროლერის ღილაკები ბოლოს თითოეულ სლაიდში გადასაადგილებლად.

ASTM A240 ტიპის 304 მილის სტანდარტული სპეციფიკაცია

ASTM A240 304 უჟანგავი ფოლადის ხვეული მილების მომწოდებლები

სპეციფიკაციები ASTM A240 / ASME SA240
სისქე 0.5მმ-100მმ
Გარეთა დიამეტრი 10 მმ, 25.4 მმ, 38.1 მმ, 50.8 მმ, 100 მმ, 250 მმ, 300 მმ, 350 მმ და ა.შ.
სიგრძე 2000 მმ, 2440 მმ, 3000 მმ, 5800 მმ, 6000 მმ და ა.შ.
ზედაპირი 2B, 2D, BA, NO.1, NO.4, NO.8, 8K, სარკე, ჩექმიანი, ჭედური, თმის ხაზი, ქვიშის აფეთქება, ფუნჯი, ოხირება და ა.შ.
დასრულება ცხელი ნაგლინი (HR), ცივი ნაგლინი მილაკი (CR), 2B, 2D, BA NO(8), SATIN (დახვდება პლასტმასის საფარით)
ფორმა მრგვალი მილი კვადრატული მილი მართკუთხა მილი და ა.შ.

304 Ruond Tube შემადგენლობა და მექანიკური მახასიათებლები

შეფასება C Mn Si P S Cr Mo Ni N
304 მინ.
მაქს.
/
0.08
/
2.0
/
0.75
/
0.045
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10.50
/
0.10
304ლ მინ.
მაქს.
/
0.03
/
2.0
/
1.0
/
0.045
/
0.030
18.00
20.00
/ 9.00
11.00
/
304 სთ მინ.
მაქს.
0.04
0.10
/
2.0
/
0.75
0.045
/
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10.50
/
შეფასება დაჭიმვის სიძლიერე
(მპა)
მოსავლიანობის სიძლიერე
0.2% დადასტურება (მპა)
დრეკადობა
(% 50 მმ-ში)
სიხისტე
როკველი ბ
(HR B)
ბრინელი
(HB)
304 515 205 40 92 201
304ლ 515 205 40 90 187
304 სთ 515 205 40 92 201

ზომები სტანდარტული, წონის დიაგრამა და ზომის გრაფიკები 304 უჟანგავი ფოლადის მილის

SS 304 მილის ზომა (მმ) SS304 მილის წონა ერთეულ ფართობზე (კგ/მ)
6*1 0.125
6*1.5 0.168
8*1 0.174
8*1.5 0.243
10*1 0.224
10*1.5 0.318
12*1 0.274
12*1.5 0.392
12*2 0.498
14*1 0.324
14*2 0.598
14*3 0.822
16*2 0.697
16*3 0.971
17*3 1.046
18*1 0.423
18*1.5 0.617
18*2 0.797
18*3 1.121
20*1 0.473
20*2 0.897
20*3 1.27
21*3 1.345
22*2 0.996
22*2.5 1.214

SPACA6 არის სპერმის მიერ გამოხატული ზედაპირული ცილა, რომელიც გადამწყვეტია გამეტების შერწყმისთვის ძუძუმწოვრების სქესობრივი გამრავლების დროს.მიუხედავად ამ ფუნდამენტური როლისა, SPACA6-ის სპეციფიკური ფუნქცია ცუდად არის გაგებული.ჩვენ განვმარტავთ SPACA6-ის უჯრედგარე დომენის კრისტალურ სტრუქტურას 2.2 Å რეზოლუციით, გამოვავლენთ ორ დომენიან ცილას, რომელიც შედგება ოთხჯაჭვიანი შეკვრისა და Ig-ის მსგავსი β-სენდვიჩებისგან, რომლებიც უერთდებიან კვაზი მოქნილი ლინკერებით.ეს სტრუქტურა წააგავს IZUMO1-ს, სხვა გამეტების შერწყმასთან ასოცირებულ პროტეინს, რომელიც ქმნის SPACA6 და IZUMO1 განაყოფიერებასთან ასოცირებული ცილების სუპეროჯახის დამფუძნებელ წევრებს, რომლებიც აქ მოიხსენიება როგორც IST სუპეროჯახი.IST სუპეროჯახი სტრუქტურულად განისაზღვრება მისი გრეხილი ოთხი სპირალის შეკვრით და დისულფიდთან დაკავშირებული CXXC მოტივებით.ადამიანის პროტეომის AlphaFold-ზე დაფუძნებული ძიების შედეგად გამოვლინდა ამ სუპეროჯახის დამატებითი ცილის წევრები;აღსანიშნავია, რომ ამ ცილებიდან ბევრი მონაწილეობს გამეტების შერწყმაში.SPACA6 სტრუქტურა და მისი ურთიერთობა IST სუპეროჯახის სხვა წევრებთან გვაძლევს დაკარგული რგოლს ძუძუმწოვრების გამეტების შერწყმის შესახებ ჩვენს ცოდნაში.
ყოველი ადამიანის სიცოცხლე იწყება ორი ცალკეული ჰაპლოიდური გამეტით: მამის სპერმატოზოიდით და დედის კვერცხუჯრედით.ეს სპერმა არის გამარჯვებული ინტენსიური შერჩევის პროცესში, რომლის დროსაც მილიონობით სპერმის უჯრედი გადის ქალის სასქესო ტრაქტში, გადალახავს სხვადასხვა დაბრკოლებებს1 და განიცდის ტევადობას, რაც აძლიერებს მათ მოძრაობას და ზედაპირის კომპონენტების პროცესს2,3,4.მაშინაც კი, თუ სპერმა და კვერცხუჯრედი ერთმანეთს პოულობენ, პროცესი ჯერ არ დასრულებულა.კვერცხუჯრედი გარშემორტყმულია კუმულუსის უჯრედების ფენით და გლიკოპროტეინის ბარიერით, რომელსაც ეწოდება ზონა პელუციდა, რომლის მეშვეობითაც სპერმა უნდა გაიაროს კვერცხუჯრედში შესასვლელად.სპერმატოზოვა იყენებს ზედაპირული ადჰეზიის მოლეკულების და მემბრანასთან ასოცირებული და გამოყოფილი ფერმენტების კომბინაციას ამ საბოლოო ბარიერების დასაძლევად5.ეს მოლეკულები და ფერმენტები ძირითადად ინახება შიდა მემბრანასა და აკროსომურ მატრიქსში და გამოვლენილია სპერმის გარე მემბრანის ლიზისას აკროსომური რეაქციის დროს6.ამ ინტენსიური მოგზაურობის ბოლო ნაბიჯი არის სპერმა-კვერცხუჯრედის შერწყმის მოვლენა, რომლის დროსაც ორი უჯრედი ერწყმის თავის გარსებს და გადაიქცევა ერთ დიპლოიდურ ორგანიზმად7.მიუხედავად იმისა, რომ ეს პროცესი ინოვაციურია ადამიანის რეპროდუქციაში, აუცილებელი მოლეკულური ურთიერთქმედება ცუდად არის გაგებული.
გარდა გამეტების განაყოფიერებისა, ფართოდ არის შესწავლილი ორი ლიპიდური ორშრის შერწყმის ქიმია.ზოგადად, მემბრანის შერწყმა არის ენერგიულად არახელსაყრელი პროცესი, რომელიც მოითხოვს ცილის კატალიზატორს სტრუქტურული კონფორმაციის ცვლილებას, რაც აახლოებს ორ მემბრანას, არღვევს მათ უწყვეტობას და იწვევს შერწყმას8,9.ეს ცილის კატალიზატორები ცნობილია როგორც ფუზოგენები და ნაპოვნი იქნა უთვალავ შერწყმის სისტემაში.ისინი საჭიროა ვირუსის შეღწევისთვის მასპინძელ უჯრედებში (მაგ., gp160 HIV-1-ში, მწვერვალი კოროვირუსებში, ჰემაგლუტინინი გრიპის ვირუსებში)10,11,12 პლაცენტური (სინციტინი)13,14,15 და გამეტების ფორმირების შერწყმა ქვედა ევკარიოტებში. HAP2/GCS1 მცენარეებში, პროტისტებსა და ართროპოდებში) 16,17,18,19.ადამიანის გამეტებისთვის ფუზოგენები ჯერ კიდევ არ არის აღმოჩენილი, თუმცა რამდენიმე ცილა კრიტიკულია გამეტების მიმაგრებისა და შერწყმისთვის.კვერცხუჯრედის გამოხატული CD9, ტრანსმემბრანული ცილა, რომელიც საჭიროა თაგვისა და ადამიანის გამეტების შერწყმისთვის, იყო პირველი, ვინც აღმოაჩინეს 21,22,23.მიუხედავად იმისა, რომ მისი ზუსტი ფუნქცია გაურკვეველია, როლი ადჰეზიაში, კვერცხუჯრედის მიკროვილებზე ადჰეზიური კერების სტრუქტურა და/ან კვერცხუჯრედის ზედაპირის ცილების სწორი ლოკალიზაცია სავარაუდოდ 24,25,26 ჩანს.ორი ყველაზე ტიპიური ცილა, რომლებიც გადამწყვეტია გამეტების შერწყმისთვის, არის სპერმის ცილა IZUMO127 და კვერცხუჯრედის ცილა JUNO28 და მათი ურთიერთკავშირი მნიშვნელოვანი ნაბიჯია გამეტების ამოცნობისა და შერწყმის წინ.მამრი Izumo1 ნოკაუტ თაგვები და მდედრი Juno ნოკაუტ თაგვები სრულიად სტერილურია, ამ მოდელებში სპერმატოზოიდები შედიან პერივიტელინურ სივრცეში, მაგრამ გამეტები არ ერწყმის.ანალოგიურად, შერწყმა შემცირდა, როდესაც გამეტებს მკურნალობდნენ ანტი-IZUMO1 ან JUNO27,29 ანტისხეულებით ადამიანის ინ ვიტრო განაყოფიერების ექსპერიმენტებში.
ახლახან აღმოაჩინეს სპერმის მიერ გამოხატული ცილების ახლად აღმოჩენილი ჯგუფი, ფენოტიპურად მსგავსი IZUMO1 და JUNO20,30,31,32,33,34,35.სპერმის აკროსომური მემბრანასთან ასოცირებული ცილა 6 (SPACA6) გამოვლინდა, როგორც არსებითი განაყოფიერებისთვის თაგვების მუტაგენეზის ფართომასშტაბიან კვლევაში.ტრანსგენის ჩასმა Spaca6 გენში წარმოქმნის შეუწვავ სპერმატოზოვას, თუმცა ეს სპერმატოზოიდები შედიან პერივიტელინურ სივრცეში 36 .თაგვებზე შემდგომმა ნოკაუტმა კვლევებმა დაადასტურა, რომ Spaca6 საჭიროა გამეტების შერწყმისთვის 30,32.SPACA6 გამოხატულია თითქმის ექსკლუზიურად სათესლე ჯირკვლებში და აქვს IZUMO1-ის მსგავსი ლოკალიზაციის ნიმუში, კერძოდ სპერმატოზოიდების ინტიმაში აკროსომულ რეაქციამდე და შემდეგ მიგრირება ეკვატორულ რეგიონში აკროსომური რეაქციის შემდეგ 30,32.Spaca6 ჰომოლოგები არსებობს სხვადასხვა ძუძუმწოვრებსა და სხვა ევკარიოტებში 30 და მისი მნიშვნელობა ადამიანის გამეტების შერწყმისთვის ნაჩვენებია ადამიანის განაყოფიერების ინ ვიტრო ინჰიბირებით SPACA6 30-ისადმი რეზისტენტობით.IZUMO1-ისა და JUNO-სგან განსხვავებით, SPACA6-ის სტრუქტურის, ურთიერთქმედების და ფუნქციის დეტალები გაურკვეველი რჩება.
ადამიანის სპერმისა და კვერცხუჯრედის შერწყმის ფუნდამენტური პროცესის უკეთ გასაგებად, რაც საშუალებას მოგვცემს მივიღოთ ინფორმაცია ოჯახის დაგეგმვისა და ნაყოფიერების მკურნალობის სამომავლო განვითარებაზე, ჩვენ ჩავატარეთ SPACA6 სტრუქტურული და ბიოქიმიური კვლევები.SPACA6-ის უჯრედგარე დომენის კრისტალური სტრუქტურა გვიჩვენებს ოთხ სპირალურ შეკვრას (4HB) და იმუნოგლობულინის მსგავს (Ig-ის მსგავსი) დომენი, რომლებიც დაკავშირებულია კვაზი-მოქნილი რეგიონებით.როგორც იწინასწარმეტყველეს წინა კვლევებში, 7,32,37 SPACA6-ის დომენის სტრუქტურა მსგავსია ადამიანის IZUMO1-ისა და ორ ცილას აქვს უჩვეულო მოტივი: 4HB სამკუთხა ხვეული ზედაპირით და დისულფიდთან დაკავშირებული CXXC მოტივებით.ჩვენ ვთავაზობთ, რომ IZUMO1 და SPACA6 ახლა განსაზღვრავენ ცილების უფრო დიდ, სტრუქტურულად დაკავშირებული სუპეროჯახს, რომლებიც დაკავშირებულია გამეტების შერწყმასთან.სუპეროჯახისთვის უნიკალური მახასიათებლების გამოყენებით, ჩვენ ჩავატარეთ AlphaFold სტრუქტურული ადამიანის პროტეომის ამომწურავი ძიება, ამ სუპეროჯახის დამატებითი წევრების იდენტიფიცირება, მათ შორის გამეტების შერწყმაში და/ან განაყოფიერებაში ჩართული რამდენიმე წევრი.ახლა ჩანს, რომ არსებობს გამეტების შერწყმასთან დაკავშირებული ცილების საერთო სტრუქტურული ნაოჭი და სუპეროჯახი და ჩვენი სტრუქტურა გვაწვდის ადამიანის გამეტების შერწყმის მექანიზმის ამ მნიშვნელოვანი ასპექტის მოლეკულურ რუკას.
SPACA6 არის ერთგავლის ტრანსმემბრანული ცილა ერთი N-დაკავშირებული გლიკანით და ექვსი სავარაუდო დისულფიდური ბმით (სურათები S1a და S2).ჩვენ გამოვხატეთ ადამიანის SPACA6-ის უჯრედგარე დომენი (ნარჩენები 27-246) Drosophila S2 უჯრედებში და გავასუფთავეთ ცილა ნიკელის აფინურობის, კათიონური გაცვლის და ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიის გამოყენებით (ნახ. S1b).გაწმენდილი SPACA6 ექტოდომინი არის ძალიან სტაბილური და ერთგვაროვანი.ანალიზმა ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიის გამოყენებით შერწყმული სინათლის მრავალკუთხა გაფანტვასთან (SEC-MALS) გამოავლინა ერთი პიკი გამოთვლილი მოლეკულური მასით 26.2 ± 0.5 kDa (ნახ. S1c).ეს შეესაბამება SPACA6 მონომერული ექტოდომინის ზომას, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ოლიგომერიზაცია არ მომხდარა გაწმენდის დროს.გარდა ამისა, წრიული დიქროიზმის (CD) სპექტროსკოპიამ გამოავლინა შერეული α/β სტრუქტურა დნობის წერტილით 51,3 °C (ნახ. S1d,e).CD სპექტრების დეკონვოლუციამ გამოავლინა 38.6% α-სპირალი და 15.8% β-ჯაჭვიანი ელემენტები (სურათი S1d).
SPACA6 ექტოდდომინი კრისტალიზებული იყო შემთხვევითი მატრიცის დათესვის გამოყენებით38, რის შედეგადაც მიღებული იქნა მონაცემთა ნაკრები 2.2 Å გარჩევადობით (ცხრილი 1 და სურათი S3).ფრაგმენტზე დაფუძნებული მოლეკულური ჩანაცვლებისა და SAD ფაზირების მონაცემების კომბინაციის გამოყენებით სტრუქტურის განსაზღვრისთვის ბრომიდის ექსპოზიციით (ცხრილი 1 და სურათი S4), საბოლოო დახვეწილი მოდელი შედგება ნარჩენებისგან 27-246.სტრუქტურის განსაზღვრის დროს, არ იყო ხელმისაწვდომი ექსპერიმენტული ან AlphaFold სტრუქტურები.SPACA6 ექტოდდომინი ზომავს 20 Å × 20 Å × 85 Å, შედგება შვიდი ხვეულისა და ცხრა β-ჯაჭვისგან და აქვს წაგრძელებული მესამეული ნაოჭი, რომელიც სტაბილიზირებულია ექვსი დისულფიდური ბმებით (ნახ. 1a, b).სუსტი ელექტრონის სიმკვრივე Asn243 გვერდითი ჯაჭვის ბოლოს მიუთითებს, რომ ეს ნარჩენი არის N-დაკავშირებული გლიკოზილირება.სტრუქტურა შედგება ორი დომენისაგან: N-ტერმინალური ოთხი სპირალის შეკვრა (4HB) და C-ტერმინალური Ig მსგავსი დომენი, მათ შორის შუალედური ჰინგის რეგიონით (ნახ. 1c).
SPACA6-ის უჯრედგარე დომენის სტრუქტურა.SPACA6-ის უჯრედგარე დომენის ზოლის დიაგრამა, ჯაჭვის ფერი N-დან C-ბოლომდე მუქი ლურჯიდან მუქ წითამდე.ცისტეინები, რომლებიც მონაწილეობენ დისულფიდურ ობლიგაციებში, ხაზგასმულია მაგენტაში.b SPACA6-ის უჯრედგარე დომენის ტოპოლოგია.გამოიყენეთ იგივე ფერის სქემა, როგორც სურათზე 1a.c SPACA6 უჯრედგარე დომენი.4HB, hinge და Ig მსგავსი დომენის ზოლის დიაგრამები შეფერილია, შესაბამისად, ნარინჯისფერი, მწვანე და ლურჯი.ფენები არ არის დახატული მასშტაბით.
SPACA6-ის 4HB დომენი მოიცავს ოთხ ძირითად ხვეულს (სპირალი 1–4), რომლებიც განლაგებულია სპირალის სახით (ნახ. 2a), რომლებიც მონაცვლეობენ ანტიპარალელურ და პარალელურ ურთიერთქმედებებს შორის (ნახ. 2ბ).მცირე დამატებითი ერთბრუნიანი სპირალი (სპირალი 1′) ჩალაგებულია შეკვრის პერპენდიკულარულად, რომელიც ქმნის სამკუთხედს 1 და 2 ხვეულებით. ნახ. 2ა).
4HB N-ტერმინალის ზოლის სქემა.b ოთხი სპირალის შეკვრის ზედა ხედი, თითოეული სპირალი ხაზგასმულია მუქი ლურჯით N-ბოლოზე და მუქ წითლად C-ბოლოზე.c ზემოდან ქვემოთ სპირალური ბორბლის დიაგრამა 4HB-სთვის, თითოეული ნარჩენით ნაჩვენებია წრეში, რომელიც მონიშნულია ერთი ასო ამინომჟავის კოდით;მხოლოდ ოთხი ამინომჟავა ბორბლის ზედა ნაწილში არის დანომრილი.არაპოლარული ნარჩენები შეღებილია ყვითლად, პოლარული დაუხტვილი ნარჩენები შეღებილია მწვანედ, დადებითად დამუხტული ნარჩენები შეღებილია ლურჯი, ხოლო უარყოფითად დამუხტული ნარჩენები შეღებილია წითლად.d 4HB დომენის სამკუთხა სახეები, 4HB-ებით ნარინჯისფერში და ანჯამებით მწვანეში.ორივე ჩანართი აჩვენებს ღეროს ფორმის დისულფიდურ ბმებს.
4HB კონცენტრირებულია შიდა ჰიდროფობიურ ბირთვზე, რომელიც შედგება ძირითადად ალიფატური და არომატული ნარჩენებისგან (ნახ. 2c).ბირთვი შეიცავს დისულფიდურ კავშირს Cys41-სა და Cys55-ს შორის, რომელიც აკავშირებს 1 და 2 სპირალებს ზედა აწეულ სამკუთხედში (ნახ. 2d).ორი დამატებითი დისულფიდური ბმა ჩამოყალიბდა CXXC მოტივს შორის Helix 1′-სა და სხვა CXXC მოტივს შორის, რომელიც ნაპოვნია β-თმის სამაგრის წვერზე საკინძების არეში (ნახ. 2d).უცნობი ფუნქციის მქონე კონსერვატიული არგინინის ნარჩენი (Arg37) მდებარეობს ღრუ სამკუთხედში, რომელიც წარმოიქმნება სპირალის 1′, 1 და 2 მიერ. ალიფატური ნახშირბადის ატომები Cβ, Cγ და Cδ Arg37 ურთიერთქმედებენ ჰიდროფობიურ ბირთვთან და მისი გუანიდინის ჯგუფები ციკლურად მოძრაობენ. სპირალებს შორის 1′ და 1 Thr32 ხერხემალსა და გვერდით ჯაჭვს შორის ურთიერთქმედების გზით (ნახ. S5a,b).Tyr34 ვრცელდება ღრუში და ტოვებს ორ პატარა ღრუს, რომლის მეშვეობითაც Arg37-ს შეუძლია ურთიერთქმედება გამხსნელთან.
Ig-ის მსგავსი β-სენდვიჩის დომენები არის პროტეინების დიდი სუპეროჯახი, რომლებსაც აქვთ საერთო მახასიათებელი ორი ან მეტი მრავალჯაჭვიანი ამფიპათიური β-ფურცლისა, რომლებიც ურთიერთქმედებენ ჰიდროფობიური ბირთვის მეშვეობით 39. SPACA6-ის C-ტერმინალის Ig მსგავსი დომენს აქვს იგივე ნიმუში. და შედგება ორი ფენისგან (სურ. S6a).ფურცელი 1 არის ოთხი ჯაჭვის β-ფურცელი (ძაფები D, F, H და I), სადაც ძაფები F, H და I ქმნიან ანტიპარალელურ განლაგებას, ხოლო I და D ძაფები იღებენ პარალელურ ურთიერთქმედებას.ცხრილი 2 არის პატარა ანტიპარალელური ორჯაჭვიანი ბეტა ფურცელი (ძაფები E და G).დაფიქსირდა შიდა დისულფიდური ბმა E ჯაჭვის C-ბოლოტსა და H ჯაჭვის ცენტრს შორის (Cys170-Cys226) (ნახ. S6b).ეს დისულფიდური ბმა არის დისულფიდური ბმის ანალოგი იმუნოგლობულინის β-სენდვიჩის დომენში40,41.
ოთხჯაჭვიანი β-ფურცელი ტრიალებს მთელ სიგრძეზე და ქმნის ასიმეტრიულ კიდეებს, რომლებიც განსხვავდება ფორმისა და ელექტროსტატიკის მიხედვით.თხელი კიდე არის ბრტყელი ჰიდროფობიური გარემო ზედაპირი, რომელიც გამოირჩევა SPACA6-ში დარჩენილ არათანაბარ და ელექტროსტატიკურად მრავალფეროვან ზედაპირებთან შედარებით (ნახ. S6b,c).ღია ხერხემლის კარბონილის/ამინო ჯგუფებისა და პოლარული გვერდითი ჯაჭვების ჰალო აკრავს ჰიდროფობიურ ზედაპირს (ნახ. S6c).უფრო ფართო ზღვარი დაფარულია დახურული სპირალური სეგმენტით, რომელიც ბლოკავს ჰიდროფობიური ბირთვის N-ტერმინალურ ნაწილს და ქმნის სამ წყალბადურ კავშირს F ჯაჭვის ხერხემლის ღია პოლარულ ჯგუფთან (ნახ. S6d).ამ კიდის C-ტერმინალური ნაწილი ქმნის დიდ ჯიბეს ნაწილობრივ დაუცველი ჰიდროფობიური ბირთვით.ჯიბე გარშემორტყმულია დადებითი მუხტებით ორმაგი არგინინის ნარჩენების სამი ნაკრების (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 და Arg212-Arg214) და ცენტრალური ჰისტიდინის (His220) გამო (სურათი S6e).
ანჯის რეგიონი არის მოკლე სეგმენტი სპირალურ დომენსა და Ig-ის მსგავს დომენს შორის, რომელიც შედგება ერთი ანტიპარალელური სამჯაჭვიანი β-შრისგან (ძაფები A, B და C), პატარა 310 სპირალი და რამდენიმე გრძელი შემთხვევითი სპირალური სეგმენტი.(ნახ. S7).კოვალენტური და ელექტროსტატიკური კონტაქტების ქსელი საკინძების რეგიონში, როგორც ჩანს, ასტაბილურებს ორიენტაციას 4HB-სა და Ig-ის მსგავს დომენს შორის.ქსელი შეიძლება დაიყოს სამ ნაწილად.პირველი ნაწილი მოიცავს ორ CXXC მოტივს (27CXXC30 და 139CXXC142), რომლებიც ქმნიან წყვილ დისულფიდურ ბმას ბეტა-თმის სამაგრსა და 4HB-ში 1' სპირალს შორის.მეორე ნაწილი მოიცავს ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებებს Ig-ის მსგავს დომენსა და ჰინგს შორის.Glu132 ჰინგში ქმნის მარილის ხიდს Arg233-თან Ig-ის მსგავს დომენში და Arg135-ით სამაგრში.მესამე ნაწილი მოიცავს კოვალენტურ კავშირს Ig-ის მსგავს დომენსა და ჰინგის რეგიონს შორის.ორი დისულფიდური ბმა (Cys124-Cys147 და Cys128-Cys153) აკავშირებს ანჯის მარყუჟს მაკავშირებელთან, რომელიც სტაბილიზირებულია Gln131-სა და ხერხემლის ფუნქციურ ჯგუფს შორის ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებით, რაც საშუალებას აძლევს წვდომას Ig-ის მსგავს პირველ დომენზე.ჯაჭვი.
SPACA6 ექტოდდომინის სტრუქტურა და 4HB და Ig მსგავსი დომენების ინდივიდუალური სტრუქტურები გამოყენებული იქნა ცილის მონაცემთა ბაზებში სტრუქტურულად მსგავსი ჩანაწერების მოსაძებნად 42 .ჩვენ გამოვავლინეთ შესატყვისები მაღალი დალი Z ქულებით, მცირე სტანდარტული გადახრებით და დიდი LALI ქულებით (ეს უკანასკნელი არის სტრუქტურულად ექვივალენტური ნარჩენების რაოდენობა).მიუხედავად იმისა, რომ პირველი 10 ჰიტი სრული ექტოდომენის ძიებიდან (ცხრილი S1) ჰქონდა მისაღები Z-ქულა >842, მხოლოდ 4HB ან Ig-ის მსგავსი დომენის ძიებამ აჩვენა, რომ ამ ჰიტების უმეტესობა შეესაბამებოდა მხოლოდ β-სენდვიჩებს.საყოველთაო ნაოჭი, რომელიც გვხვდება ბევრ ცილაში.დალიში სამივე ძიებამ მხოლოდ ერთი შედეგი დააბრუნა: IZUMO1.
დიდი ხანია ვარაუდობენ, რომ SPACA6 და IZUMO1 იზიარებენ სტრუქტურულ მსგავსებებს7,32,37.მიუხედავად იმისა, რომ ამ ორი გამეტის შერწყმასთან დაკავშირებული პროტეინის ექტოდომინები იზიარებენ მხოლოდ 21% თანმიმდევრობის იდენტურობას (სურათი S8a), კომპლექსური მტკიცებულება, მათ შორის კონსერვირებული დისულფიდური კავშირის ნიმუში და პროგნოზირებული C-ტერმინალური Ig მსგავსი დომენი SPACA6-ში, საშუალებას აძლევდა ადრეული მცდელობების შექმნას. A და SPACA6 თაგვის ჰომოლოგიური მოდელი შაბლონად IZUMO1-ის გამოყენებით37.ჩვენი სტრუქტურა ადასტურებს ამ პროგნოზებს და აჩვენებს მსგავსების ნამდვილ ხარისხს.სინამდვილეში, SPACA6 და IZUMO137,43,44 სტრუქტურები იზიარებენ ერთსა და იმავე ორ დომენიან არქიტექტურას (ნახ. S8b) მსგავსი 4HB და Ig-ის მსგავსი β-სენდვიჩის დომენებით, რომლებიც დაკავშირებულია ჰინგის რეგიონით (ნახ. S8c).
IZUMO1 და SPACA6 4HB-ს საერთო განსხვავებები აქვთ ჩვეულებრივი სპირალური ჩალიჩებისგან.ტიპიურ 4HB-ებს, როგორიცაა SNARE ცილოვანი კომპლექსები, რომლებიც მონაწილეობენ ენდოსომურ შერწყმაში 45,46, აქვთ თანაბრად განლაგებული ხვეულები, რომლებიც ინარჩუნებენ მუდმივ გამრუდებას ცენტრალური ღერძის ირგვლივ 47. ამის საპირისპიროდ, სპირალური დომენები როგორც IZUMO1-ში, ასევე SPACA6-ში იყო დამახინჯებული, ცვლადი გამრუდებით და არათანაბარი შეფუთვა (სურათი S8d).გრეხილი, რომელიც სავარაუდოდ გამოწვეულია 1′, 1 და 2 ხვეულებით წარმოქმნილი სამკუთხედით, შენარჩუნებულია IZUMO1-სა და SPACA6-ში და სტაბილიზირებულია იგივე CXXC მოტივით სპირალზე 1′.თუმცა, SPACA6-ში ნაპოვნი დამატებითი დისულფიდური ბმა (Cys41 და Cys55 კოვალენტურად დამაკავშირებელი სპირალის 1 და 2 ზემოთ) ქმნის უფრო მკვეთრ მწვერვალს სამკუთხედის მწვერვალზე, რაც ხდის SPACA6-ს უფრო გრეხილს, ვიდრე IZUMO1, უფრო გამოხატული ღრუს სამკუთხედებით.გარდა ამისა, IZUMO1-ს აკლია Arg37, რომელიც დაფიქსირდა ამ ღრუს ცენტრში SPACA6-ში.ამის საპირისპიროდ, IZUMO1-ს აქვს ალიფატური და არომატული ნარჩენების უფრო ტიპიური ჰიდროფობიური ბირთვი.
IZUMO1-ს აქვს Ig-ის მსგავსი დომენი, რომელიც შედგება ორჯაჭვიანი და ხუთჯაჭვიანი β-ფურცლისგან43.დამატებითი ჯაჭვი IZUMO1-ში ცვლის ხვეულს SPACA6-ში, რომელიც ურთიერთქმედებს F ჯაჭვთან, რათა შეზღუდოს ხერხემლის წყალბადის ბმები ძაფში.შედარების საინტერესო წერტილი არის ორი ცილის Ig მსგავსი დომენების პროგნოზირებული ზედაპირული მუხტი.IZUMO1 ზედაპირი უფრო უარყოფითად არის დამუხტული ვიდრე SPACA6 ზედაპირი.დამატებითი მუხტი განლაგებულია სპერმის მემბრანისკენ მიმავალი C-ტერმინალის მახლობლად.SPACA6-ში, იგივე რეგიონები იყო უფრო ნეიტრალური ან დადებითად დამუხტული (ნახ. S8e).მაგალითად, ჰიდროფობიური ზედაპირი (უფრო თხელი კიდეები) და დადებითად დამუხტული ორმოები (უფრო ფართო კიდეები) SPACA6-ში უარყოფითად არის დამუხტული IZUMO1-ში.
მიუხედავად იმისა, რომ კავშირი და მეორადი სტრუქტურის ელემენტები IZUMO1-სა და SPACA6-ს შორის კარგად არის შემონახული, Ig-ის მსგავსი დომენების სტრუქტურულმა განლაგებამ აჩვენა, რომ ორი დომენი განსხვავდება მათი ზოგადი ორიენტაციის მიხედვით (ნახ. S9).IZUMO1-ის სპირალური შეკვრა არის მოხრილი β-სენდვიჩის გარშემო, რაც ქმნის ადრე აღწერილ „ბუმერანგის“ ფორმას ცენტრალური ღერძიდან დაახლოებით 50°-ით.ამის საპირისპიროდ, SPACA6-ში ხვეული სხივი საპირისპირო მიმართულებით დაახლოებით 10°-ით იყო დახრილი.ამ ორიენტაციების განსხვავებები სავარაუდოდ განპირობებულია საკინძების რეგიონში განსხვავებებით.პირველადი თანმიმდევრობის დონეზე, IZUMO1 და SPACA6 იზიარებენ მცირე თანმიმდევრობის მსგავსებას საყრდენზე, ცისტეინის, გლიცინის და ასპარტინის მჟავის ნარჩენების გარდა.შედეგად, წყალბადის ბმები და ელექტროსტატიკური ქსელები სრულიად განსხვავებულია.β-ფურცლის მეორადი სტრუქტურის ელემენტებს იზიარებენ IZUMO1 და SPACA6, თუმცა IZUMO1-ში ჯაჭვები გაცილებით გრძელია და 310 სპირალი (სპირალი 5) უნიკალურია SPACA6-ისთვის.ეს განსხვავებები იწვევს სხვადასხვა დომენის ორიენტაციას ორი სხვაგვარად მსგავსი პროტეინისთვის.
დალის სერვერის ჩვენმა ძიებამ აჩვენა, რომ SPACA6 და IZUMO1 არის მხოლოდ ორი ექსპერიმენტულად განსაზღვრული სტრუქტურა, რომლებიც ინახება ცილების მონაცემთა ბაზაში, რომლებსაც აქვთ ეს კონკრეტული 4HB ნაკეცი (ცხრილი S1).ცოტა ხნის წინ DeepMind-მა (Alphabet/Google) შეიმუშავა AlphaFold, ნერვულ ქსელზე დაფუძნებული სისტემა, რომელსაც შეუძლია ზუსტად განსაზღვროს ცილების 3D სტრუქტურები პირველადი თანმიმდევრობიდან48.SPACA6 სტრუქტურის ამოხსნის შემდეგ მალევე გამოვიდა AlphaFold მონაცემთა ბაზა, რომელიც უზრუნველყოფს პროგნოზირებადი სტრუქტურის მოდელებს, რომლებიც მოიცავს ადამიანის პროტეომში არსებული ყველა ცილის 98.5%-ს48,49.ჩვენი გადაჭრილი SPACA6 სტრუქტურის, როგორც საძიებო მოდელის გამოყენებით, მოდელის სტრუქტურულმა ჰომოლოგიურმა ძიებამ AlphaFold ადამიანის პროტეომში გამოავლინა კანდიდატები, რომლებსაც შესაძლო სტრუქტურული მსგავსება აქვთ SPACA6-თან და IZUMO1-თან.თუ გავითვალისწინებთ AlphaFold-ის წარმოუდგენელ სიზუსტეს SPACA6-ის პროგნოზირებაში (ნახ. S10a) - განსაკუთრებით 1.1 Å rms ექტოდდომინი ჩვენს გადაწყვეტილ სტრუქტურასთან შედარებით (ნახ. S10b) - შეგვიძლია დარწმუნებული ვიყოთ, რომ SPACA6-ის გამოვლენილი შესატყვისები, სავარაუდოდ, ზუსტი იქნება.
ადრე, PSI-BLAST ეძებდა IZUMO1 კლასტერს სამი სხვა სპერმასთან დაკავშირებული ცილებით: IZUMO2, IZUMO3 და IZUMO450.AlphaFold-მა იწინასწარმეტყველა, რომ ეს IZUMO ოჯახის პროტეინები იკეცება 4HB დომენში იგივე დისულფიდური კავშირის ნიმუშით, როგორც IZUMO1 (სურათები 3a და S11), თუმცა მათ არ აქვთ Ig მსგავსი დომენი.ვარაუდობენ, რომ IZUMO2 და IZUMO3 არის ცალმხრივი მემბრანის ცილები მსგავსი IZUMO1, ხოლო IZUMO4, როგორც ჩანს, გამოიყოფა.IZUMO 2, 3 და 4 ცილების ფუნქციები გამეტების შერწყმაში დადგენილი არ არის.ცნობილია, რომ IZUMO3 როლს ასრულებს აკროსომების ბიოგენეზში სპერმის განვითარების დროს51 და აღმოჩნდა, რომ IZUMO ცილა ქმნის კომპლექსს50.IZUMO ცილების კონსერვაცია ძუძუმწოვრებში, ქვეწარმავლებში და ამფიბიებში ვარაუდობს, რომ მათი პოტენციური ფუნქცია შეესაბამება სხვა ცნობილი გამეტების შერწყმასთან ასოცირებულ ცილებს, როგორიცაა DCST1/2, SOF1 და FIMP.
IST სუპეროჯახის დომენის არქიტექტურის დიაგრამა, 4HB, hinge და Ig-ის მსგავსი დომენებით, რომლებიც ხაზგასმულია შესაბამისად ნარინჯისფერში, მწვანეში და ლურჯში.IZUMO4-ს აქვს უნიკალური C-ტერმინალის რეგიონი, რომელიც გამოიყურება შავი.დადასტურებული და სავარაუდო დისულფიდური ბმები ნაჩვენებია, შესაბამისად, მყარი და წერტილოვანი ხაზებით.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), და DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ნაჩვენებია იმავე ფერის დიაპაზონში, როგორც პანელის A. დისულფიდური ბმები ნაჩვენებია მაგენტაში.TMEM95, IZUMO2 და IZUMO3 ტრანსმემბრანული ხვეული არ არის ნაჩვენები.
IZUMO ცილისგან განსხვავებით, სხვა SPACA პროტეინები (ანუ SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 და SPACA9) სტრუქტურულად განსხვავდებიან SPACA6-ისგან (ნახ. S12).მხოლოდ SPACA9-ს აქვს 4HB, მაგრამ მოსალოდნელი არ არის, რომ მას ჰქონდეს იგივე პარალელური ანტიპარალელური ორიენტაცია ან იგივე დისულფიდური ბმა, როგორც SPACA6.მხოლოდ SPACA1-ს აქვს მსგავსი Ig-ის მსგავსი დომენი.AlphaFold პროგნოზირებს, რომ SPACA3, SPACA4 და SPACA5 აქვთ სრულიად განსხვავებული სტრუქტურა, ვიდრე SPACA6.საინტერესოა, რომ SPACA4 ასევე ცნობილია, რომ თამაშობს როლს განაყოფიერებაში, მაგრამ უფრო მეტად, ვიდრე SPACA6, სამაგიეროდ, ხელს უწყობს ურთიერთქმედებას სპერმასა და კვერცხუჯრედს შორის pellucida52.
ჩვენმა AlphaFold ძიებამ იპოვა სხვა შესატყვისი IZUMO1 და SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, ერთი სპერმის სპეციფიკური ტრანსმემბრანული ცილა, მამრ თაგვებს უნაყოფო ხდის 32,33 აბლაციისას.სპერმატოზოვას, რომელსაც აკლია TMEM95, გააჩნდა ნორმალური მორფოლოგია, მოძრაობა და უნარი შეაღწიოს ზონაში გამჭვირვალე გარსს და შეაერთოს კვერცხუჯრედის მემბრანას, მაგრამ ვერ ერწყმის კვერცხუჯრედის მემბრანას.წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ TMEM95 იზიარებს სტრუქტურულ მსგავსებას IZUMO133-თან.მართლაც, AlphaFold მოდელმა დაადასტურა, რომ TMEM95 არის 4HB CXXC მოტივების იგივე წყვილი, როგორც IZUMO1 და SPACA6 და იგივე დამატებითი დისულფიდური კავშირი 1 და 2 სპირალებს შორის, ნაპოვნი SPACA6-ში (ნახ. 3a და S11).მიუხედავად იმისა, რომ TMEM95-ს არ გააჩნია Ig-ის მსგავსი დომენი, მას აქვს რეგიონი დისულფიდური კავშირის ნიმუშით SPACA6 და IZUMO1 საკინძების რეგიონების მსგავსი (ნახ. 3b).ამ ხელნაწერის გამოქვეყნების დროს, წინასწარი ბეჭდვის სერვერმა მოახსენა TMEM95-ის სტრუქტურა, რომელიც ადასტურებს AlphaFold53 შედეგს.TMEM95 ძალიან ჰგავს SPACA6-ს და IZUMO1-ს და ევოლუციურად არის კონსერვირებული უკვე ამფიბიებში (ნახ. 4 და S13).
PSI-BLAST ძიებამ გამოიყენა NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP და SOF1 მონაცემთა ბაზები სიცოცხლის ხეში ამ თანმიმდევრობების პოზიციის დასადგენად.განშტოების წერტილებს შორის მანძილი არ არის ნაჩვენები მასშტაბით.
გასაოცარი საერთო სტრუქტურული მსგავსება SPACA6-სა და IZUMO1-ს შორის ვარაუდობს, რომ ისინი წარმოადგენენ შენარჩუნებული სტრუქტურული სუპეროჯახის დამფუძნებელ წევრებს, რომელიც მოიცავს TMEM95 და IZUMO 2, 3 და 4 ცილებს.ცნობილი წევრები: IZUMO1, SPACA6 და TMEM95.იმის გამო, რომ მხოლოდ რამდენიმე წევრს აქვს Ig მსგავსი დომენები, IST სუპეროჯახის დამახასიათებელი ნიშანია 4HB დომენი, რომელსაც აქვს უნიკალური თვისებები, რომლებიც საერთოა ყველა ამ ცილისთვის: 1) დახვეული 4HB ხვეულებით, რომლებიც განლაგებულია ანტიპარალელური/პარალელური მონაცვლეობით (ნახ. . 5a), 2) შეკვრას აქვს სამკუთხა სახე, რომელიც შედგება ორი ხვეულისგან შეკვრაში და მესამე ვერტიკალური სპირალისაგან (ნახ. საკვანძო არე (ნახ. 5c). ცნობილია, რომ ფუნქციონირებს CXXC მოტივი, რომელიც გვხვდება თიორედოქსინის მსგავს ცილებში. როგორც რედოქსის სენსორი 54,55,56, ხოლო IST ოჯახის წევრებში მოტივი შეიძლება ასოცირებული იყოს ცილის დისულფიდურ იზომერაზებთან, როგორიცაა ERp57 გამეტების შერწყმაში. როლები დაკავშირებულია 57,58.
IST სუპეროჯახის წევრები განისაზღვრება 4HB დომენის სამი დამახასიათებელი მახასიათებლით: ოთხი ხვეული, რომლებიც მონაცვლეობენ პარალელურ და ანტიპარალელურ ორიენტაციას შორის, ba-სპირალისებური შეკვრის სახეები და მცირე მოლეკულებს შორის წარმოქმნილი ca CXXC ორმაგი მოტივი.) N-ტერმინალური სპირალი (ნარინჯისფერი) და საკინძების რეგიონი β- თმის სამაგრი (მწვანე).
SPACA6-სა და IZUMO1-ს შორის მსგავსების გათვალისწინებით, შემოწმებული იქნა პირველის IZUMO1-თან ან JUNO-თან დაკავშირების უნარი.ბიოფენების ინტერფერომეტრია (BLI) არის კინეტიკური დაფუძნებული შებოჭვის მეთოდი, რომელიც ადრე გამოიყენებოდა IZUMO1-სა და JUNO-ს შორის ურთიერთქმედების რაოდენობრივ დასადგენად.ბიოტინით მარკირებული სენსორის ინკუბაციის შემდეგ IZUMO1-ით, როგორც სატყუარას JUNO ანალიზის მაღალი კონცენტრაციით, გამოვლინდა ძლიერი სიგნალი (ნახ. S14a), რომელიც მიუთითებს სენსორის წვერზე მიმაგრებული ბიომასალის სისქეში შებოჭვით გამოწვეულ ცვლილებაზე.მსგავსი სიგნალები (ე.ი. JUNO დაწყვილებულია სენსორთან, როგორც სატყუარა IZUMO1 ანალიტის წინააღმდეგ) (ნახ. S14b).არ იყო გამოვლენილი სიგნალი, როდესაც SPACA6 გამოიყენებოდა როგორც ანალიტი სენსორზე შეკრული IZUMO1-ის ან სენსორით შეკრული JUNO-ს წინააღმდეგ (სურათი S14a,b).ამ სიგნალის არარსებობა მიუთითებს იმაზე, რომ SPACA6-ის უჯრედგარე დომენი არ ურთიერთქმედებს IZUMO1 ან JUNO-ს უჯრედგარე დომენთან.
იმის გამო, რომ BLI ანალიზი დაფუძნებულია სატყუარას ცილაზე თავისუფალი ლიზინის ნარჩენების ბიოტინილაციაზე, ამ მოდიფიკაციამ შეიძლება თავიდან აიცილოს შეკავშირება, თუ ლიზინის ნარჩენები ჩართულია ურთიერთქმედებაში.გარდა ამისა, სენსორთან შეკავშირების ორიენტაციამ შეიძლება შექმნას სტერილური დაბრკოლებები, ამიტომ ჩვეულებრივი ჩამოსაშლელი ანალიზები ასევე ჩატარდა რეკომბინანტულ SPACA6, IZUMO1 და JUNO ექტოდომენებზე.ამის მიუხედავად, SPACA6 არ დალექილა His-tagged IZUMO1-თან ან His-tagged JUNO-სთან (ნახ. S14c,d), რაც არ მიუთითებს BLI ექსპერიმენტებში დაფიქსირებულ ურთიერთქმედებებთან შესაბამისობაში.როგორც დადებითი კონტროლი, ჩვენ დავადასტურეთ JUNO-ს ურთიერთქმედება ეტიკეტირებულ His IZUMO1-თან (სურათები S14e და S15).
SPACA6-სა და IZUMO1-ს შორის სტრუქტურული მსგავსების მიუხედავად, SPACA6-ის შეუძლებლობა შეაერთოს JUNO არ არის გასაკვირი.ადამიანის IZUMO1-ის ზედაპირს აქვს 20-ზე მეტი ნარჩენი, რომლებიც ურთიერთქმედებენ JUNO-სთან, მათ შორის ნარჩენები სამივე რეგიონიდან (თუმცა მათი უმეტესობა განლაგებულია საკინძების რეგიონში) (ნახ. S14f).ამ ნარჩენებიდან მხოლოდ ერთია დაცული SPACA6-ში (Glu70).მიუხედავად იმისა, რომ ნარჩენების ბევრმა შემცვლელმა შეინარჩუნა თავდაპირველი ბიოქიმიური თვისებები, აუცილებელი Arg160 ნარჩენი IZUMO1-ში შეიცვალა უარყოფითად დამუხტული Asp148-ით SPACA6-ში;წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ Arg160Glu მუტაცია IZUMO1-ში თითქმის მთლიანად აჩერებს JUNO43-თან დაკავშირებას.გარდა ამისა, დომენის ორიენტაციის სხვაობამ IZUMO1-სა და SPACA6-ს შორის მნიშვნელოვნად გაზარდა SPACA6-ზე ეკვივალენტური რეგიონის JUNO-დაკავშირების ადგილის ზედაპირის ფართობი (ნახ. S14g).
მიუხედავად იმისა, რომ ცნობილია SPACA6-ის საჭიროება გამეტების შერწყმისთვის და მისი მსგავსება IZUMO1-თან, როგორც ჩანს, SPACA6-ს არ გააჩნია ექვივალენტური JUNO-ს შეკავშირების ფუნქცია.ამიტომ, ჩვენ ვცდილობდით გავაერთიანოთ ჩვენი სტრუქტურული მონაცემები ევოლუციური ბიოლოგიის მიერ მოწოდებული მნიშვნელობის მტკიცებულებებთან.SPACA6 ჰომოლოგების თანმიმდევრობით გასწორება გვიჩვენებს საერთო სტრუქტურის კონსერვაციას ძუძუმწოვრების მიღმა.მაგალითად, ცისტეინის ნარჩენები გვხვდება შორეულ მონათესავე ამფიბიებშიც კი (ნახ. 6a).ConSurf სერვერის გამოყენებით, 66 მიმდევრობის მრავალჯერადი თანმიმდევრობის გასწორების მონაცემები დატანილი იქნა SPACA6 ზედაპირზე.ამ ტიპის ანალიზს შეუძლია აჩვენოს, თუ რომელი ნარჩენები იქნა დაცული ცილების ევოლუციის დროს და შეუძლია მიუთითოს, თუ რომელი ზედაპირის რეგიონები თამაშობენ როლს ფუნქციაში.
SPACA6 ექტოდომინების თანმიმდევრული გასწორება 12 სხვადასხვა სახეობიდან, მომზადებული CLUSTAL OMEGA-ს გამოყენებით.ConSurf-ის ანალიზის მიხედვით, ყველაზე კონსერვატიული პოზიციები ლურჯად არის მონიშნული.ცისტეინის ნარჩენები ხაზგასმულია წითლად.დომენის საზღვრები და მეორადი სტრუქტურის ელემენტები ნაჩვენებია გასწორების ზედა ნაწილში, სადაც ისრები მიუთითებს β-სტრიქონებს და ტალღები მიუთითებს ხვეულებზე.NCBI წვდომის იდენტიფიკატორები, რომლებიც შეიცავს თანმიმდევრობებს არის: ადამიანი (Homo sapiens, NP_001303901), მანდრილი (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), მაიმუნი კაპუცინი (Cebus mimic, XP_017359360), XP_01735930366, XP_01735930390, 201359303901, 201359303901, 20135930390, 20 ცხენის ბურთი (20135930366) Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), ცხვარი (Ovis aries, XP_014955560), სპილო (Loxodonta africana, XP_010585293), ძაღლი (Canis lupus familyis, XP_025277208), თაგვი (Mus musculus, NP_001156manianph1081), თაგვი (Mus musculus, NP_001156manianph101), სპილო (Harrisco_381), , XP_0318), პლატიპუსი, 8) , 61_89 და Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).ნუმერაცია ეფუძნება ადამიანის წესრიგს.b SPACA6 სტრუქტურის ზედაპირის გამოსახულება 4HB ზევით და Ig მსგავსი დომენით ბოლოში, ფერები ConSurf სერვერის კონსერვაციის შეფასებებზე დაფუძნებული.ყველაზე კარგად შემონახული ნაწილები ლურჯია, ზომიერად შემონახული ნაწილები თეთრია, ყველაზე ნაკლებად შემონახული კი ყვითელი.მეწამული ცისტეინი.სამი ზედაპირული ლაქი, რომელიც ასახავს დაცვის მაღალ დონეს, ნაჩვენებია ჩანართის ეტიკეტზე 1, 2 და 3. 4HB მულტფილმი ნაჩვენებია ჩასმაში ზედა მარჯვენა მხარეს (იგივე ფერის სქემა).
SPACA6 სტრუქტურას აქვს სამი უაღრესად დაცული ზედაპირის რეგიონი (ნახ. 6b).პატჩი 1 მოიცავს 4HB-ს და საკინძების ზონას და შეიცავს ორ შენახულ CXXC დისულფიდურ ხიდს, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 საკინძების ქსელს (ნახ. S7) და სამ კონსერვარებულ გარე არომატულ ნარჩენს (Phe31, Tyr73, Phe137).Ig მსგავსი დომენის უფრო ფართო რგოლი (ნახ. S6e), რომელიც წარმოადგენს რამდენიმე დადებითად დამუხტულ ნარჩენს სპერმის ზედაპირზე.საინტერესოა, რომ ეს პატჩი შეიცავს ანტისხეულის ეპიტოპს, რომელიც ადრე აჩვენა, რომ ხელს უშლის SPACA6 30 ფუნქციას.რეგიონი 3 მოიცავს Ig-ის მსგავსი დომენის ჰინგსა და ერთ მხარეს;ეს რეგიონი შეიცავს დაკონსერვებულ პროლინებს (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) და გარეგნულ პოლარულ/დამუხტულ ნარჩენებს.გასაკვირია, რომ 4HB-ის ზედაპირზე ნარჩენების უმეტესობა ძალზე ცვალებადია (ნახ. 6b), თუმცა ნაოჭი შენარჩუნებულია მთელს SPACA6 ჰომოლოგში (როგორც მითითებულია ჰიდროფობიური შეკვრის ბირთვის კონსერვატიზმით) და IST სუპეროჯახის მიღმა.
მიუხედავად იმისა, რომ ეს არის ყველაზე პატარა რეგიონი SPACA6-ში, ყველაზე ცოტა შესამჩნევი მეორადი სტრუქტურის ელემენტებით, ბევრი ჰინგური რეგიონის ნარჩენი (მათ შორის რეგიონი 3) ძლიერად არის დაცული SPACA6 ჰომოლოგებს შორის, რაც შეიძლება მიუთითებდეს, რომ ხვეული შეკვრისა და β-სენდვიჩის ორიენტაცია თამაშობს როლს.როგორც კონსერვატორი.თუმცა, მიუხედავად ვრცელი წყალბადის კავშირისა და ელექტროსტატიკური ქსელებისა SPACA6-ისა და IZUMO1-ის საკინძების რეგიონში, შინაგანი მოქნილობის მტკიცებულება ჩანს IZUMO137,43,44-ის მრავალჯერადი დაშვებული სტრუქტურების გასწორებაში.ცალკეული დომენების გასწორება კარგად ემთხვეოდა, მაგრამ დომენების ორიენტაცია ერთმანეთთან შედარებით მერყეობდა 50°-დან 70°-მდე ცენტრალური ღერძიდან (ნახ. S16).SPACA6-ის კონფორმაციული დინამიკის გასაგებად ხსნარში ჩატარდა SAXS ექსპერიმენტები (ნახ. S17a,b).SPACA6 ექტოდომინის აბსპექტიული რეკონსტრუქცია შეესაბამებოდა როდ კრისტალურ სტრუქტურას (ნახ. S18), თუმცა კრატკის ნაკვეთმა აჩვენა მოქნილობის გარკვეული ხარისხი (ნახ. S17b).ეს კონფორმაცია ეწინააღმდეგება IZUMO1-ს, რომელშიც შეუკავშირებელი ცილა ბუმერანგის ფორმას იღებს როგორც გისოსში, ასევე ხსნარში43.
მოქნილი რეგიონის კონკრეტულად იდენტიფიცირებისთვის, წყალბად-დეიტერიუმის გაცვლის მასის სპექტროსკოპია (H-DXMS) ჩატარდა SPACA6-ზე და შედარება IZUMO143-ზე ადრე მიღებულ მონაცემებთან (ნახ. 7a,b).SPACA6 აშკარად უფრო მოქნილია ვიდრე IZUMO1, რასაც მოწმობს დეიტერიუმის მაღალი გაცვლა მთელ სტრუქტურაში 100000 წმ გაცვლის შემდეგ.ორივე სტრუქტურაში, საკინძების რეგიონის C-ტერმინალური ნაწილი აჩვენებს გაცვლის მაღალ დონეს, რაც, სავარაუდოდ, იძლევა 4HB და Ig მსგავსი დომენების შეზღუდული ბრუნვის საშუალებას ერთმანეთთან შედარებით.საინტერესოა, რომ SPACA6 ჰინგის C-ტერმინალური ნაწილი, რომელიც შედგება 147CDLPLDCP154 ნარჩენებისგან, არის უაღრესად კონსერვირებული რეგიონი 3 (ნახ. 6b), რაც შესაძლოა მიუთითებს, რომ დომენთაშორისი მოქნილობა არის SPACA6-ის ევოლუციურად შენახული მახასიათებელი.მოქნილობის ანალიზის მიხედვით, CD თერმული დნობის მონაცემებმა აჩვენა, რომ SPACA6 (Tm = 51,2°C) ნაკლებად სტაბილურია ვიდრე IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (ნახ. S1e და S19).
a SPACA6-ისა და b IZUMO1-ის H-DXMS სურათები.დეიტერიუმის გაცვლის პროცენტული მაჩვენებელი განისაზღვრა მითითებულ დროში.წყალბად-დეიტერიუმის გაცვლის დონეები მითითებულია ფერით გრადიენტური შკალით ლურჯიდან (10%) წითელამდე (90%).შავი ყუთები წარმოადგენს მაღალი გაცვლის სფეროებს.კრისტალურ სტრუქტურაში დაფიქსირებული 4HB, ჰინგისა და Ig მსგავსი დომენის საზღვრები ნაჩვენებია პირველადი თანმიმდევრობის ზემოთ.დეიტერიუმის გაცვლის დონეები 10 წამში, 1000 წმ და 100,000 წმ-ზე იყო გამოსახული ზოლიან დიაგრამაზე, რომელიც გადახურულია SPACA6-ისა და IZUMO1-ის გამჭვირვალე მოლეკულურ ზედაპირებზე.სტრუქტურების ნაწილები, რომელთა დეიტერიუმის გაცვლის დონე 50% -ზე დაბალია, შეღებილია თეთრი.50% H-DXMS გაცვლის ზევით უბნები შეღებილია გრადიენტური მასშტაბით.
CRISPR/Cas9-ისა და თაგვის გენის ნოკაუტის გენეტიკური სტრატეგიების გამოყენებამ გამოიწვია სპერმის და კვერცხუჯრედის შეკავშირებისა და შერწყმისთვის მნიშვნელოვანი რამდენიმე ფაქტორის იდენტიფიცირება.გარდა IZUMO1-JUNO და CD9 სტრუქტურის კარგად დახასიათებული ურთიერთქმედებისა, ცილების უმეტესობა, რომლებიც დაკავშირებულია გამეტების შერწყმასთან, რჩება სტრუქტურულად და ფუნქციურად იდუმალი.SPACA6-ის ბიოფიზიკური და სტრუქტურული დახასიათება განაყოფიერების დროს ადჰეზიის/შერწყმის მოლეკულური თავსატეხის კიდევ ერთი ნაწილია.
SPACA6 და IST სუპეროჯახის სხვა წევრები, როგორც ჩანს, ძალიან კონსერვირებულია როგორც ძუძუმწოვრებში, ასევე ცალკეულ ფრინველებში, ქვეწარმავლებში და ამფიბიებში;სინამდვილეში, ითვლება, რომ SPACA6 საჭიროა ზებრათევში განაყოფიერებისთვისაც კი 59. ეს განაწილება მსგავსია სხვა ცნობილი გამეტების შერწყმასთან ასოცირებულ პროტეინებთან, როგორიცაა DCST134, DCST234, FIMP31 და SOF132, რაც ვარაუდობს, რომ ეს ფაქტორები HAP2-დეფიციტურია (ასევე ცნობილია როგორც GCS1) ცილები, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან მრავალი პროტისტის კატალიზურ აქტივობაზე., მცენარეები და ართროპოდები.განაყოფიერებული შერწყმის პროტეინები 60, 61. SPACA6-სა და IZUMO1-ს შორის ძლიერი სტრუქტურული მსგავსების მიუხედავად, რომელიმე ამ ცილის მაკოდირებელი გენების ნოკაუტმა გამოიწვია მამრ თაგვებში უნაყოფობა, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მათი ფუნქციები გამეტების შერწყმაში არ არის დუბლირებული..უფრო ფართოდ, არცერთი ცნობილი სპერმის ცილა, რომელიც საჭიროა შერწყმის ადჰეზიის ფაზაში, ზედმეტი არ არის.
ღიად რჩება კითხვა, მონაწილეობენ თუ არა SPACA6 (და IST სუპეროჯახის სხვა წევრები) გამეტათშორის შეერთებებში, აყალიბებენ ინტრაგამეტურ ქსელებს მნიშვნელოვანი ცილების შერწყმის წერტილებში გადასაღები, ან შესაძლოა იმოქმედონ, როგორც გაუგებარი ფუზოგენები.HEK293T უჯრედებში ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციის კვლევებმა გამოავლინა ურთიერთქმედება სრული სიგრძის IZUMO1-სა და SPACA632-ს შორის.თუმცა, ჩვენი რეკომბინანტული ექტოდომინები არ ურთიერთქმედებდნენ ინ ვიტროში, რაც ვარაუდობს, რომ ურთიერთქმედებები ჩანს Noda et al.ორივე წაშლილია კონსტრუქციაში (გაითვალისწინეთ IZUMO1-ის ციტოპლაზმური კუდი, რომელიც აღმოჩნდა არასაჭირო განაყოფიერებისთვის62).ალტერნატიულად, IZUMO1 და/ან SPACA6 შეიძლება მოითხოვოს სპეციფიკური შემაკავშირებელი გარემო, რომელსაც ჩვენ არ ვაწარმოებთ in vitro, როგორიცაა ფიზიოლოგიურად სპეციფიკური კონფორმაციები ან მოლეკულური კომპლექსები, რომლებიც შეიცავს სხვა ცილებს (ცნობილი ან ჯერ არ არის აღმოჩენილი).მიუხედავად იმისა, რომ მიჩნეულია, რომ IZUMO1 ექტოდდომინი შუამავლობს სპერმატოზოიდების მიმაგრებას კვერცხუჯრედთან პერივიტელურ სივრცეში, SPACA6 ექტოდდომინის დანიშნულება გაურკვეველია.
SPACA6-ის სტრუქტურა ავლენს რამდენიმე შენახულ ზედაპირს, რომელიც შეიძლება ჩართული იყოს ცილა-ცილის ურთიერთქმედებაში.საკინძების რეგიონის დაკონსერვებულ ნაწილს უშუალოდ CXXC მოტივთან (აღნიშნული პაჩი 1 ზემოთ) აქვს რამდენიმე გარე მიმართული არომატული ნარჩენი, რომლებიც ხშირად ასოცირდება ბიომოლეკულებს შორის ჰიდროფობიურ და π-დაწყობის ურთიერთქმედებებთან.Ig-ის მსგავსი დომენის ფართო მხარეები (რეგიონი 2) ქმნიან დადებითად დამუხტულ ღარს უაღრესად კონსერვირებული Arg და მისი ნარჩენებით, და ანტისხეულები ამ რეგიონის წინააღმდეგ ადრე გამოიყენებოდა გამეტების შერწყმის დასაბლოკად 30 .ანტისხეული ცნობს ხაზოვან ეპიტოპს 212RIRPAQLTHRGTFS225, რომელსაც აქვს სამი არგინინის ექვსი ნარჩენი და მაღალკონსერვირებული His220.არ არის ნათელი, არის თუ არა დისფუნქცია ამ კონკრეტული ნარჩენების ბლოკირებით თუ მთელი რეგიონის გამო.ამ უფსკრულის მდებარეობა β-სენდვიჩის C-ბოლოსთან ახლოს მიუთითებს ცის-ურთიერთქმედებას მეზობელ სპერმის ცილებთან, მაგრამ არა კვერცხუჯრედის ცილებთან.გარდა ამისა, უაღრესად მოქნილი პროლინით მდიდარი ხახუნის შეკავება (ადგილი 3) სამაგრში შეიძლება იყოს ცილა-ცილის ურთიერთქმედების ადგილი ან, უფრო სავარაუდოა, მიუთითებდეს მოქნილობის შენარჩუნებაზე ორ დომენს შორის.სქესი მნიშვნელოვანია SPACA6-ის უცნობი როლისთვის.გამეტების შერწყმა.
SPACA6-ს აქვს უჯრედშორისი ადჰეზიური ცილების თვისებები, მათ შორის Ig-ის მსგავსი β-სენდვიჩები.ბევრ წებოვან ცილას (მაგ., კადერინებს, ინტეგრინს, ადჰეზინებს და IZUMO1) გააჩნია ერთი ან მეტი β-სენდვიჩის დომენი, რომელიც ავრცელებს ცილებს უჯრედის მემბრანიდან მათ გარემო მიზნებამდე63,64,65.SPACA6-ის Ig-ის მსგავსი დომენი ასევე შეიცავს მოტივს, რომელიც ჩვეულებრივ გვხვდება ადჰეზიისა და შეკრულობის β-სენდვიჩებში: პარალელური ძაფების დუბლი β-სენდვიჩების ბოლოებზე, რომლებიც ცნობილია როგორც მექანიკური დამჭერები66.ითვლება, რომ ეს მოტივი ზრდის ათვლის ძალების წინააღმდეგობას, რაც ღირებულია უჯრედშორის ურთიერთქმედებებში ჩართული ცილებისთვის.თუმცა, ადჰეზინებთან ამ მსგავსების მიუხედავად, ამჟამად არ არსებობს მტკიცებულება, რომ SPACA6 ურთიერთქმედებს კვერცხის ცილებთან.SPACA6 ექტოდომინი ვერ აკავშირებს JUNO-ს და SPACA6-ის გამოხატული HEK293T უჯრედები, როგორც აქ ნაჩვენებია, ძნელად ურთიერთქმედებენ კვერცხუჯრედებთან, რომლებსაც აკლია ზონა 32 .თუ SPACA6 აყალიბებს ინტერგამეტურ ობლიგაციებს, ამ ურთიერთქმედებას შეიძლება დასჭირდეს ტრანსლაციური ცვლილებები ან სტაბილიზირებული იყოს სპერმის სხვა ცილებით.ამ უკანასკნელი ჰიპოთეზის მხარდასაჭერად, IZUMO1-დეფიციტური სპერმატოზოიდები უკავშირდებიან კვერცხუჯრედებს, რაც აჩვენებს, რომ IZUMO1-ის გარდა სხვა მოლეკულები მონაწილეობენ გამეტების ადჰეზიის საფეხურში 27.
ბევრ ვირუსულ, უჯრედულ და განვითარების შერწყმა ცილას აქვს თვისებები, რომლებიც პროგნოზირებს მათ, როგორც ფუზოგენის ფუნქციას.მაგალითად, ვირუსული შერწყმის გლიკოპროტეინებს (I, II და III კლასები) აქვთ ჰიდროფობიური შერწყმის პეპტიდი ან მარყუჟი ცილის ბოლოს, რომელიც ჩასმულია მასპინძლის მემბრანაში.IZUMO143-ის ჰიდროფილურობის რუკამ და IST სუპეროჯახის სტრუქტურა (განსაზღვრული და პროგნოზირებული) არ აჩვენა აშკარა ჰიდროფობიური შერწყმის პეპტიდი.ამრიგად, თუ IST სუპეროჯახის რომელიმე ცილა ფუნქციონირებს როგორც ფუზოგენი, ისინი ამას სხვა ცნობილი მაგალითებისგან განსხვავებულად აკეთებენ.
დასკვნის სახით, ცილების IST სუპეროჯახის წევრების ფუნქციები, რომლებიც დაკავშირებულია გამეტების შერწყმასთან, მაოცებ საიდუმლოდ რჩება.ჩვენი დამახასიათებელი SPACA6 რეკომბინანტული მოლეკულა და მისი ამოღებული სტრუქტურა საშუალებას მოგცემთ გაეცნოთ ამ საერთო სტრუქტურებს შორის ურთიერთობებს და მათ როლს გამეტების მიმაგრებასა და შერწყმაში.
დნმ-ის თანმიმდევრობა, რომელიც შეესაბამება ადამიანის SPACA6 პროგნოზირებულ ექტოდომინს (NCBI დაშვების ნომერი NP_001303901.1; ნარჩენები 27-246) იყო კოდონის ოპტიმიზებული ექსპრესიისთვის Drosophila melanogaster S2 უჯრედებში და სინთეზირებული იყო როგორც გენის ფრაგმენტები GenicsE-ს თანმიმდევრობით (GenicsEurofin encoding)., BiP სეკრეციის სიგნალი და შესაბამისი 5' და 3' ბოლოები ამ გენის ლიგაციისგან დამოუკიდებელი კლონირებისთვის pMT ექსპრესიის ვექტორში, რომელიც დაფუძნებულია მეტალოთიონეინის პრომოტორზე, რომელიც შეცვლილია პურომიცინით შერჩევისთვის (pMT-puro).pMT-puro ვექტორი კოდირებს თრომბინის გაყოფის ადგილს, რასაც მოჰყვება 10x-His C-ტერმინალური ტეგი (სურათი S2).
SPACA6 pMT-puro ვექტორის სტაბილური ტრანსფექცია D. melanogaster S2 (Gibco) უჯრედებში განხორციელდა IZUMO1 და JUNO43-ისთვის გამოყენებული პროტოკოლის მსგავსად.S2 უჯრედები გალღვა და გაიზარდა შნაიდერის გარემოში (Gibco), რომელსაც დაემატა 10% (ვ/ვ) სითბოს ინაქტივირებული ნაყოფის ხბოს შრატი (Gibco) და 1X ანტიმიკოზური ანტიბიოტიკი (Gibco) საბოლოო კონცენტრაციით.ადრეული გადასასვლელი უჯრედები (3.0 x 106 უჯრედი) იყო მოთავსებული 6 ჭაბურღილის ფირფიტების ცალკეულ ჭებში (Corning).27°C-ზე ინკუბაციიდან 24 საათის შემდეგ, უჯრედები გადაკეთდა 2 მგ SPACA6 pMT-puro ვექტორისა და Effectene ტრანსფექციის რეაგენტის (Qiagen) ნარევით მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.ტრანსფექტირებული უჯრედები ინკუბირებული იყო 72 საათის განმავლობაში და შემდეგ აღებული იქნა 6 მგ/მლ პურომიცინით.შემდეგ უჯრედები იზოლირებული იქნა შნაიდერის სრული გარემოდან და მოათავსეს შრატისგან თავისუფალ Insect-XPRESS გარემოში (Lonza) პროტეინის ფართომასშტაბიანი წარმოებისთვის.S2 უჯრედული კულტურის 1 ლიტრიანი პარტია გაიზარდა 8-10 × 106 მლ-1 უჯრედებამდე 2 ლიტრიანი ვენტილირებადი ბრტყელძირიანი პოლიპროპილენის ერლენმაიერის კოლბაში და შემდეგ სტერილიზაცია 500 μM CuSO4 (Milipore Sigma) საბოლოო კონცენტრაციით და სტერილურად გაფილტრული.გამოწვეული.ინდუცირებული კულტურები ინკუბირებული იყო 27°C-ზე 120 rpm-ზე ოთხი დღის განმავლობაში.
SPACA6-ის შემცველი კონდიცირებული გარემო იზოლირებული იყო ცენტრიფუგაციით 5660×g 4°C-ზე, რასაც მოჰყვა Centramate tangential ნაკადის ფილტრაციის სისტემა (Pall Corp) 10 kDa MWCO მემბრანით.SPACA6-ის შემცველი კონცენტრირებული გარემო დაიტანეთ 2 მლ Ni-NTA აგაროზის ფისის (Qiagen) სვეტზე.Ni-NTA ფისი გარეცხილი იყო A ბუფერის 10 სვეტის მოცულობით (CV) და შემდეგ დაემატა 1 CV ბუფერ A-ს, რათა მიეღო იმიდაზოლის საბოლოო კონცენტრაცია 50 მმ.SPACA6 გამოირეცხა 10 მლ ბუფერ A-ით, რომელსაც დაემატა იმიდაზოლი 500 მმ-ის საბოლოო კონცენტრაციამდე.შეზღუდვის კლასის თრომბინი (Millipore Sigma) დაემატა უშუალოდ დიალიზის მილში (MWCO 12-14 kDa) 1 ერთეული მგ SPACA6-ზე 1 ლ 10 მმ Tris-HCl, pH 7.5 და 150 მმ NaCl (ბუფერი B) დიალიზისთვის.) 4°C-ზე 48 საათის განმავლობაში.თრომბინით დაშლილი SPACA6 შემდეგ სამჯერ განზავდა მარილის კონცენტრაციის შესამცირებლად და ჩაიტვირთა 1 მლ MonoS 5/50 GL კათიონგაცვლის სვეტში (Cytiva/GE) დაბალანსებული 10 მმ Tris-HCl, pH 7.5.კატიონ გადამცვლელი გარეცხილი იყო 3 CV 10 mM Tris-HCl-ით, pH 7.5, შემდეგ SPACA6 გამოირეცხა ხაზოვანი გრადიენტით 0-დან 500 mM NaCl-მდე 10 mM Tris-HCl-ში, pH 7.5 25 CV-სთვის.იონგაცვლის ქრომატოგრაფიის შემდეგ, SPACA6 კონცენტრირებული იყო 1 მლ-მდე და გამოირეცხებოდა იზოკრატიულად ENrich SEC650 10 x 300 სვეტიდან (BioRad) დაბალანსებული ბუფერით B. ქრომატოგრამის მიხედვით, SPACA6-ის შემცველი აუზი და კონცენტრატული ფრაქციები.სისუფთავე კონტროლდებოდა Coomassie-ით შეღებილი ელექტროფორეზით 16% SDS-პოლიაკრილამიდის გელზე.ცილის კონცენტრაცია რაოდენობრივად განისაზღვრა შთანთქმის გზით 280 ნმ-ზე ბერ-ლამბერტის კანონის და თეორიული მოლარული გადაშენების კოეფიციენტის გამოყენებით.
გაწმენდილი SPACA6 იყო დიალიზებული ღამით 10 მმ ნატრიუმის ფოსფატის, pH 7.4 და 150 მმ NaF-ის წინააღმდეგ და განზავებული იყო 0.16 მგ/მლ-მდე CD სპექტროსკოპიით ანალიზამდე.185-დან 260 ნმ ტალღის სიგრძით CD-ების სპექტრული სკანირება შეგროვდა Jasco J-1500 სპექტროპოლარიმეტრზე კვარცის კუვეტების გამოყენებით 1 მმ ოპტიკური ბილიკის სიგრძით (Helma) 25°C სიჩქარით 50 ნმ/წთ.CD სპექტრები საბაზისო კორექტირებულ იქნა, საშუალოდ 10 შეძენისას და გადაკეთდა საშუალო ნარჩენ ელიფტიურობად (θMRE) გრადუსებში სმ2/დმოლში:
სადაც MW არის თითოეული ნიმუშის მოლეკულური წონა Da-ში;N არის ამინომჟავების რაოდენობა;θ არის ელიფტიურობა მილიგრადებში;d შეესაბამება ოპტიკური გზის სიგრძეს სმ-ში;ცილის კონცენტრაცია ერთეულებში.

 


გამოქვეყნების დრო: მარ-01-2023